Architektur des Heme

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 5190 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Mono- und Multihäm-Cytochrome c werden durch die kovalente Bindung von Häm posttranslational gereift. Zu diesem Zweck nutzt Escherichia coli die komplexeste Art von Reifungsmaschinerie, das Ccm-System (für die Cytochrom-C-Reifung). Es besteht aus zwei Membranproteinkomplexen, von denen einer Häm durch die Membran zu einem mobilen Chaperon transportiert, das dann den Cofaktor zur kovalenten Bindung an den zweiten Komplex, eine Apoprotein:Häm-Lyase, weiterleitet. Hier berichten wir über kryoelektronenmikroskopische Strukturen des Häm-Translokationskomplexes CcmABCD aus E. coli, allein und gebunden an das Häm-Chaperon CcmE. CcmABCD bildet einen heterooktameren Komplex um den ABC-Transporter CcmAB, der selbst kein Häm transportiert. Unsere Daten deuten darauf hin, dass der Komplex an seinen CcmBC-Grenzflächen eine Hämgruppe von der inneren zur äußeren Packungsbeilage umlagert, angetrieben durch die ATP-Hydrolyse an CcmA. Ein konserviertes Häm-Handling-Motiv (WxWD) auf der periplasmatischen Seite von CcmC dreht das Häm um 90° für eine kovalente Bindung an das Häm-Chaperon CcmE, das unserer Meinung nach ausschließlich mit der CcmB-Untereinheit interagiert.

Cytochrome c sind eine vielfältige und vielseitige Familie von Metalloproteinen, die in allen Lebensbereichen vorkommen1. Sie enthalten eine oder mehrere Kopien des Tetrapyrrol-Cofaktors Fe-Protoporphyrin IX oder Häm, und ihr charakteristisches Merkmal ist die kovalente Bindung dieser metallorganischen Einheit an charakteristische Bindungsmotive der Sequenz C-Xn-CH (am häufigsten n = 2; Ergänzung). Abb. 1a)2. Der Zweck dieser posttranslationalen Modifikation ist mindestens zweifach. Erstens werden Cytochrome c ausnahmslos in einer extrazytoplasmatischen Umgebung eingesetzt, sodass die kovalente Bindung dazu dient, den Verlust von Cofaktoren zu verhindern. Zweitens entfällt durch die Fixierung der Hämgruppen an der Peptidkette die Notwendigkeit, sperrige Bindungstaschen zu bilden, was ein sehr hohes Cofaktor-Protein-Verhältnis und damit die Bildung dicht gepackter Ketten von Hämgruppen innerhalb eines einzelnen Proteins ermöglicht3. Folglich sind die typischen Rollen von Cytochrom c die Elektronenübertragung oder die Katalyse von Mehrelektronen-Redoxreaktionen4. Das bekannteste Mitglied dieser Proteinfamilie ist wohl das Monohäm Cytochrom c aus der mitochondrialen Atmungskette, wo es Elektronen vom Cytochrom bc1-Komplex zur Cytochrom c-Oxidase5 transportiert. Allerdings haben Prokaryoten Systeme mit weitaus höherer Komplexität6 entwickelt, mit mehreren und bis zu Dutzenden von Hämgruppen auf einer einzelnen Peptidkette. Ausgewählte Organismen wie Geobacter Sulfurreducens kodieren in ihrem Genom mehr als einhundert Multihäm-Cytochrome c7. Die Reifung von Cytochrom c ist aufwändig. Apo-Cytochrome enthalten eine Signalsequenz für den Export aus dem Zytoplasma über das Sec-Translokon, und die entstehende Peptidkette wird dann im extrazytoplasmatischen Kompartiment durch einen Häm-Lyase-Komplex verarbeitet, der die Häm-bindenden Motive erkennt und die kovalente Bindung des Cofaktors vermittelt Hinzufügen der beiden Cystein-Thiolgruppen zu seinen Vinylseitenketten. Bemerkenswert ist, dass dieser Prozess unabhängig von der Gesamtsequenz des Proteins ist und für Apocytochrome sehr unterschiedlicher Größe funktioniert. Die Peptidkette wird von der Lyase gescannt, die spezifisch Häm-bindende Motive erkennt. In allen bekannten Häm-Lyasen spielen Proteine ​​der „Häm-handling“-Familie eine entscheidende Rolle, und ihr Markenzeichen ist ein tryptophanreiches Motiv, kurz „WxWD-Motiv“, durch das die Cofaktoren für die Interaktion mit dem Protein gehalten und positioniert werden8 . Da es sich bei Cytochrom c um eine evolutionär alte Proteinfamilie handelt, haben sich die Maturasen im Laufe der Zeit diversifiziert, und in aktuellen Klassifizierungen sind fünf verschiedene Systeme von Häm-Lyasen aufgeführt9,10. Das komplexeste davon ist System I, das Ccm-System (für die Reifung von Cytochrom C), das in α- und β-Proteobakterien, pflanzlichen Mitochondrien, Deinokokken, Archaeen und einigen γ- und δ-Proteobakterien vorkommt. In den meisten Fällen ist es in einem einzelnen Operon der Zusammensetzung ccmABCDEFGHI (ergänzende Abbildung 1b) kodiert, dessen Proteinprodukte zwei Membran-Integral-Proteinkomplexe mit unterschiedlicher Funktionalität bilden . Hier dient ein CcmFHI-Komplex als Häm-Lyase-Modul, das das Apopeptid scannt, über ein Thioredoxin-Modul Disulfide reduziert, die sich möglicherweise in der oxidierenden Umgebung gebildet haben, und Häm-Cofaktoren an die Kern-Lyase-Untereinheit CcmF bindet12,13. CcmG ist ein DsbA-ähnliches Thioredoxin, das reduzierende Äquivalente für den Lyasekomplex bereitstellt. Das zweite Modul ist CcmABCD, ein weiterer integraler Membranproteinkomplex, der sich um den ABC-Transporter CcmAB dreht. Es wurde als Häm-Exporter beschrieben, der die Cofaktoren durch die Membran transportiert, um sie an das Häm-Chaperon CcmE im Periplasma zu binden14. CcmE ist ein monotopes Membranprotein, das sich zu einer kompakten β-Barrel-Domäne faltet und mit einem Histidinrest in seinem flexiblen C-terminalen Schwanz eine kovalente Verbindung zu Häm bildet15,16. CcmE ist das Element, das den Häm-Translokationskomplex CcmABCD und den Häm-Lyase-Komplex CcmFHI17 verbindet, und obwohl CcmF ausnahmslos eine Hämgruppe vom b-Typ enthält, sind nur über CcmE gelieferte Cofaktoren mit den Apo-Cytochrom-Ketten verknüpft (ergänzende Abbildung). 1c).

Wir haben kürzlich über die Struktur einer Kernuntereinheit der Hämlyase, des CcmF-Proteins aus Thermus thermophilus, berichtet, die durch Röntgenkristallographie bestimmt wurde18. Die Struktur offenbarte eine beispiellose Faltung für Membranproteine ​​und zeigte die akzessorische b-Typ-Hämgruppe, die sich am Boden eines trichterartigen Kanals befindet, der die gesamte Membran zu durchziehen scheint. Während sich das b-Typ-Häm jedoch innerhalb des zytoplasmatischen Blättchens befand, wies die periplasmatische Seite des Kanals eine breite seitliche Öffnung in die Membran auf. Basierend auf der Größe und Form dieses Eingangs und des angrenzenden Proteinhohlraums haben wir ein „Bojenmodell“ für die Wirkung von CcmE vorgeschlagen, bei dem das Chaperon die Hämgruppe nicht tatsächlich in das Periplasma extrahiert, sondern vielmehr den hydrophoben Cofaktor im Lipid zurückhält Doppelschicht, um es in die Öffnung in CcmF18 zu leiten. Um zu klären, wie CcmE in Verbindung mit der Lyase funktioniert, untersuchten wir die andere wichtige Wechselwirkung des Chaperons, seine Beladung mit Häm am CcmABCD-Komplex. In dieser Arbeit produzieren und isolieren wir CcmABCD- und CcmABCDE-Komplexe aus dem γ-Proteobakterium Escherichia coli und bestimmen ihre Struktur durch Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM)-Einzelpartikelanalyse. Zuletzt berichteten Kranz, Zhang, Zhu und Mitarbeiter auch über Strukturen eines Ccm(AB)2CD-Komplexes aus E. coli19. Stattdessen finden wir eine vorherrschende Stöchiometrie mit zwei Kopien von CcmCD und identifizieren den Bindungsmodus des Chaperons CcmE an diesen Komplex. Unsere Daten stützen weiterhin das Bojenmodell der CcmE-Aktion und legen nahe, dass dieser ungewöhnliche ABC-Transporter als Häm-Floppase fungiert.

E. coli nutzt ein ccmABCDEFGH-Operon für die Cytochrom-C-Reifung, wobei das CcmH-Protein eine Fusion der CcmH- und CcmI-Proteine ​​darstellt, die separat in anderen Organismen vorkommen, die das System I20 verwenden. Der Modellprokaryont kodiert in seinem Genom nur sechs C-Typ-Cytochrome, die ausschließlich während des anaeroben Wachstums produziert werden. Um die rekombinante Produktion von c-Typ-Cytochromen unter oxischen Bedingungen zu ermöglichen, haben Thöny-Meyer und Mitarbeiter das akzessorische Plasmid pEC86 geschaffen, das das Ccm-System von einem konstitutiven Promotor in trans21 aus exprimiert. Hier haben wir eine Reihe von Expressionskonstrukten für Komponenten des Ccm-Systems von E. coli generiert und einen CcmABCDE-Komplex isoliert, der mit DDM oder GDN solubilisiert und durch Affinitäts- und Größenausschlusschromatographie isoliert wurde (ergänzende Abbildung 2a, b). Diese Probe wurde dann durch Kryo-EM-Einzelpartikelanalyse charakterisiert und Klassen, die einen Ccm(ABCD)2- und einen Ccm(ABCD)2E-Komplex (siehe unten) repräsentieren, verfeinert, was zu Strukturmodellen mit Auflösungen von 3,47 Å und 3,81 Å führte (Ergänzende Abbildung 3).

Die Proteine ​​CcmA und CcmB sind die jeweiligen ABC-Module und Transmembran-Untereinheiten eines kanonischen ABC-Transporters. Ursprünglich wurde vorgeschlagen, dass sie als Häm-Exporteur14 fungieren und ein Ccm(AB)2-Heterotetramer nach den kanonischen Architekturprinzipien von ABC-Transportern aufbauen. Anschließend wurde festgestellt, dass das Tetramer einen Komplex mit dem Häm-handhabenden Protein CcmC bildet, das das WxWD-Motiv17 und das kleine, aber wichtige monotope CcmD22 enthält. In Übereinstimmung damit ergab die aktuelle Kryo-EM-Analyse einen Ccm(AB)2CD-Komplex19, der zuvor von AF2Complex23 recht genau vorhergesagt wurde, der wiederum auf AlphaFold24 aufbaut. In unserer Analyse ist die Ccm(AB)2-Einheit auch der Kern des Komplexes, aber bereits in den ersten 2D-Kursen wurde sofort deutlich, dass die Anordnung symmetrisch war (Abb. 1a), mit CcmCD-Modulen auf beiden Seiten des Kerns Transporter, was zu einem Ccm(ABCD)2-Heterooctamer mit einer Gesamtmasse von 164 kDa und 26 Transmembranhelices führte (Abb. 1b, c; ergänzende Abb. 4). Der ABC-Transporter befand sich in einem nukleotidfreien, nach innen offenen Zustand, ohne direkten Kontakt zwischen den beiden nukleotidbindenden CcmA-Untereinheiten. Das 201 aa CcmA erreichte die kanonische ABC-Domänenfaltung im Zusammenhang mit P-Loop-ATPasen, mit einem P-Loop (Walker A-Motiv) 36GSNGAGKT43, der die Nukleotidbindungsstelle bildet, sowie einer Switch-I-Region 179GIVLTTHQP188 und einer Switch-II-Region ( Walker-B-Motiv) 152LDEPFTAIDV161, das bei der Nukleotidbindung typischerweise Konformationsänderungen erfährt, und die Lidschleife 81IGHQPGIKTRL91, die für die Interaktion mit CcmB entscheidend ist (Abb. 1d). In allen Motiven sind die fettgedruckten konservierten Reste an der Bindung von MgATP beteiligt. Im nukleotidfreien Zustand des Komplexes gab es keine direkten Wechselwirkungen zwischen den beiden Kopien von CcmA, ihre Massenschwerpunkte lagen 36 Å voneinander entfernt.

Eine 2D-Klasse des CcmABCD-Datensatzes zeigte eine symmetrische Hülle in einer elliptischen Mizelle. b Einzelpartikelrekonstruktion von nukleotidfreiem Ccm(ABCD)2 mit einer Auflösung von 3,47 Å von vorne (oben) und Draufsicht vom Periplasma (unten). In der schematischen Darstellung rechts sind die Untereinheiten sowie die Vorder- und Rückseite der CcmBC-Schnittstelle beschriftet. c Cartoon-Darstellung des 194-kDa-Komplexes in der Membran. Färbung der Untereinheiten gemäß (b). d Die ATPase-Untereinheit CcmA im nukleotidfreien Zustand, gefärbt von blau am N-Terminus bis rot am C-Terminus. Konservierte Motive von P-Loop-ATPasen sowie die im Text diskutierten Reste sind angegeben. e CcmB, die Transmembran-Untereinheit des zentralen ABC-Transporters. TM-Helices sind beschriftet und die Position der Membran und der benachbarten CcmA- und CcmB'-Untereinheiten ist angegeben. f Die Häm-translozierende Untereinheit CcmC mit dem Häm-handhabenden Motiv WxWD in der Schleife, die die TM-Helices hIII und hIV verbindet. Die g-Untereinheit CcmD mit einer einzelnen TM-Helix war vollständig definiert und erstreckt sich 35 Å in das Zytoplasma.

CcmB ist ein integrales Membranprotein mit sechs Transmembran-α-Helices und einer charakteristischen amphipathischen „Ellbogenhelix“ an seinem N-Terminus, die parallel zur Membranebene liegt und durch ionische Wechselwirkungen zwischen den konservierten D73 und K96 sowie E10 an Ort und Stelle gehalten wird und R68 (Abb. 1e). CcmB verbindet die Helices hII und hIII auf der zytoplasmatischen Seite der Membran und enthält die charakteristische Kopplungshelix aus den Resten 78–84, die die Wechselwirkung der Transmembran-Untereinheit mit der Nukleotid-bindenden Untereinheit CcmA25 vermittelt. Phylogenetisch gruppiert sich CcmAB mit der Exporterfamilie ABC-A2 der ABC-Transporter26 oder – gemäß einer neueren Klassifikation – mit Typ-V-Exporteuren (Floppasen)27. System-I-Cytochrom-c-Maturasen kommen auch in pflanzlichen Mitochondrien vor, und bei Arabidopsis thaliana ist das Gen für die ATPase CCMA in der Kern-DNA kodiert, während ccmB im mitochondrialen Genom zu finden ist28. Das CcmC-Protein ist ebenfalls ein integrales Membranprotein mit sechs Transmembranhelices (Abb. 1c). Zusammen mit den Häm-Lyase-Komponenten CcmF und Ccs(B)A bildet es die Familie der „Häm-handling-Proteine“ mit einem 114WXKXXWGXΩWXWDXRLT130-Motiv (CcmC-Nummerierung), kurz „WxWD“, in der Schleifenregion, die die Transmembranhelices hIII und hIV verbindet die periplasmatische Seite der Membran (Abb. 1c, f)8. Der terminale Aspartatrest dieses Motivs, D126, bedeckt die Helix IV, indem er kurze Wasserstoffbrückenbindungen von den Rückgrat-Amidstickstoffatomen der Reste A127 und R128 (siehe unten) aufnimmt und so eine negative Ladung bereitstellt, um das Dipolmoment der Helix in einer Anordnung zu kompensieren sehr ähnlich denen, die in der Kristallstruktur von CcmF von T. thermophilus18 und der Kryo-EM-Struktur von CcsBA29 beobachtet wurden (ergänzende Abbildung 5). Es wurde berichtet, dass die letzte Untereinheit des Komplexes, CcmD, für die Dissoziation von CcmE nach der Übertragung der Hämgruppe erforderlich ist22,30. CcmD hat seinen N-Terminus im Periplasma, wo es mit einer amphipathischen Helix beginnt, die die ersten 18 Reste parallel zur Membrangrenze platziert (Abb. 1g). Vom Rest A18D bis M41D durchquert es die Membran ausschließlich mit hydrophoben Resten, mit der bemerkenswerten Ausnahme von H38D, das sich innerhalb der Membran befindet, etwa 5 Å von der Zytoplasmafläche entfernt. Beim Verlassen der Membran erstreckt sich CcmD mehr als 35 Å in das Zytoplasma. Wie aus der zunehmenden Unordnung der Kryo-EM-Karten hervorgeht (Abb. 1g), ist der C-Terminus von CcmD ziemlich flexibel und wir beobachten nie eine direkte Interaktion mit den nahegelegenen CcmA-Untereinheiten. Der Rest R54D bildet jedoch drei kurze Wasserstoffbrücken zur kurzen Helix am C-Terminus von CcmC, die ebenfalls parallel zur zytoplasmatischen Seite der Membran ausgerichtet ist. Die CcmABCD/E-Proben wurden zusammen mit gebundenem Häm b in einem oxidierten Zustand gereinigt, was durch eine α-Bande bei 560 nm bei der Reduktion angezeigt wird (ergänzende Abbildung 2c). In den Strukturanalysen verschiedener Komplexe wurde kein gebundenes Häm gefunden, während im aktuellen Bericht über einen Ccm(AB)2CD-Komplex Häm-gebundene Strukturen erhalten wurden, hier wurde jedoch vor der Kryo-EM-Analyse externes Hämin hinzugefügt19. Wir hatten diese Strategie nicht befolgt und dies führte vermutlich zum Verlust des nichtkovalent gebundenen Cofaktors während der Gittervorbereitung.

Die Gesamtarchitektur des CcmABCD-Komplexes in seinem nukleotidfreien Zustand ist somit ein C2-symmetrisches Heteroctamer mit Abmessungen von 100 Å × 80 Å × 60 Å. Es enthält eine ausgeprägte Furche zwischen den CcmB-, CcmC- und CcmD-Untereinheiten auf beiden Seiten, die durch die WxWD-Schleife von CcmC an der periplasmatischen Grenzfläche abgedeckt wird. Für die folgende Diskussion bezeichnen wir diese Seite des Komplexes als „Vorderseite“ und die gegenüberliegende Seite mit einer eher flachen CcmBC-Schnittstelle als „Rückseite“ (Abb. 1b).

Um strukturelle Informationen über den ATP-gebundenen Zustand von CcmAB zu erhalten, haben wir eine E154QA-Variante generiert, die das katalytische Glutamat in der Switch-II-Region der Nukleotid-bindenden Untereinheit ersetzt (Abb. 1d), um ein Protein zu erhalten, das jedoch nicht zur ATP-Hydrolyse fähig ist bindet immer noch das Nukleotid31,32. Diese Variante wurde als Wildtyp isoliert (Ergänzungsabbildung 2a, b), enthielt jedoch kein gebundenes Häm (Ergänzungsabbildung 2d). Wie erwartet fixierte die Einzelpunktmutation in der Nukleotidbindungsstelle von CcmA den Transporter in einer geschlossenen Konformation und verkürzte den Abstand zwischen den Massenschwerpunkten der beiden CcmA-Untereinheiten von 36 Å auf 29,4 Å (Abb. 2a). In dieser Probe war kein Häm gebunden, und wir erhielten einen Datensatz, der CcmA ohne und einen mit gebundenem ATP enthielt, mit nur geringfügigen Änderungen an der Gesamtkonformation des Komplexes (Ergänzungstabelle 1). Vom nach innen offenen Zustand des nukleotidfreien Ccm(AB)2-Heterotetramers wechselte die E154QA-Variante in eine vollständig geschlossene Konfiguration ohne inneren Hohlraum von ausreichender Größe, um ein Frachtmolekül von der Größe eines Häm-Cofaktors aufzunehmen. Die Bindungsstellen für ATP befanden sich nahe der Grenzfläche des CcmA-Dimers (Abb. 2b), wobei der Rest S130 des anderen Monomers an der Koordination der ATP-Phosphate beteiligt war. ATP band an seine kanonische Position in dieser Proteinklasse, wobei die P-Schleife das Triphosphat in der Nähe der Switch-I- und Switch-II-Regionen und der Lid-Schleife umschließt (Abb. 2c). Die allgemeinen Konformationsänderungen in den verschiedenen Zuständen von CcmA waren subtil, und die nukleotidfreie Wildtypstruktur (Abb. 2d) zeigte jedoch die gleiche Konformation der P-Schleife wie die nukleotidfreie E154QA-Variante (Abb. 2e). Letzterer schaltete den Transporter in den geschlossenen Zustand. Erst bei der Bindung von MgATP änderte sich die Konformation der P-Schleife wesentlich, auch in der Deckelschleife, wo H83 das Mg2+-Kation koordinierte (Abb. 2f).

a Einzelpartikelrekonstruktion von nukleotidfreiem CcmAB im offenen Zustand (links) und der ATP-gebundenen E154QA-Variante im geschlossenen Zustand (rechts). b Das CcmA-Dimer der E154QA-Variante mit 2 ATP gebunden an der Dimer-Schnittstelle (grau). c Detail der ATP-Bindungsstelle in einem Monomer von CcmA mit den funktionellen Motiven der P-Loop-NTPase-Familie. d Konformation der P-Schleife in nativem CcmA (offener Zustand). e Konformation der P-Schleife in der E154QA-Variante ohne gebundenes ATP. f ATP-Bindung in der E154QA-Variante. g Vergleich der Konformationen des inneren und äußeren CcmB-Monomers (siehe Abb. 3a) im nukleotidfreien Wildtyp (grau) und der E154QA-Variante (schwarz). Im äußeren Monomer erfolgt der wesentliche Wechsel der Helix hV nur im asymmetrischen ATP-gebundenen Komplex. h Stereobild der asymmetrischen Konformationsänderung, die im ungehinderten Monomer von CcmB (transparent) beobachtet wurde, überlagert mit dem zweiten Monomer, das an CcmC gebunden blieb (fest). Die Verlängerung von hV von CcmB würde zu einem sterischen Konflikt mit der Helix hIV von CcmC führen.

Unerwarteterweise änderte sich die Gesamtstöchiometrie von CcmABCD für die E154QA-Variante, da die Schließung des ABC-Kerntransporters Ccm(AB)2 durchweg zum Verlust einer Kopie von CcmCD führte, was zu einem Ccm(E154QAB)2CD-Komplex führte (Abb . 3a, Ergänzung Abb. 6, Ergänzungsfilm 1). Diese grundlegende Änderung der Quartärstruktur führte zu einer strukturellen Asymmetrie der beiden CcmB-Protomere. Das innere Protomer von CcmB (Abb. 3a) behielt weitgehend seine Konformation im offenen Zustand bei, wie dies auch für die angrenzenden verbleibenden Kopien von CcmC und CcmD der Fall war. Das äußere Protomer, das nun nicht mehr durch Wechselwirkungen mit CcmCD eingeschränkt ist, erfuhr eine Konformationsänderung, die sich am stärksten auf die zytoplasmatischen Termini seiner Transmembranhelices hI und hV auswirkte (Abb. 2g). Im äußeren Protomer des E154QA-Variantenkomplexes bewegten sich die zytoplasmatischen Enden beider Helices vom Kern des CcmB-Dimers um 7,0 Å im Fall von hI und 8,1 Å für hV nach außen (Abb. 2g, h). Diese letztere Verschiebung hätte einen erheblichen Konflikt mit der Transmembranhelix hIV von CcmC verursacht und ist daher wahrscheinlich der Grund für die Dissoziation der zweiten Kopie von CcmCD von einem heterooctameren Ccm(ABCD)2-Komplex (Zusatzfilm 2). Die veränderte Stöchiometrie der Untereinheiten entsprach nun auch der der kürzlich berichteten Ccm(AB)2CD-Strukturen, wobei AMPPNP- (PDB 7F03) und ATP-gebundene (PDB 7F04) Strukturen eine geschlossene Konformation ähnlich der unserer E154QA-Variante zeigten, während a Die zweite 3D-Rekonstruktion aus der ATP-gebundenen Probe mit gebundenem Häm wurde als halboffen (PDB 7VFP) bezeichnet, mit einer Konformation, die dem hier bestimmten nukleotidfreien Zustand sehr ähnlich ist19. Li et al. berichteten auch über einen nukleotidfreien offenen Zustand mit einem größeren Abstand zwischen den beiden Kopien von CcmA (PDB 7VFJ). Wir haben diese Form nicht gefunden, gehen jedoch davon aus, dass diese weitere Öffnung des Transporters möglicherweise nur möglich ist, weil in ihren Vorbereitungen kein zweites CcmCD-Modul vorhanden ist. Obwohl dies von den Autoren nicht diskutiert wurde, zeigten diese Strukturen auch eine konsistente Asymmetrie der beiden Kopien von CcmB, die in der weit offenen Apo-Form des Komplexes (PDB 7VFJ) am wenigsten ausgeprägt ist. Nur hier zeigen die Helices hI und hV nach innen, aber da es keine zweite Kopie der CcmCD-Helix gibt, ist hI immer noch weniger im CcmB-Dimer vergraben als in unserer Struktur des symmetrischen Ccm(ABCD)2-Komplexes. In allen anderen Strukturen zeigten die Helices hI und hV nur im ungehemmten äußeren Protomer nach außen, was daher möglicherweise auch zur Freisetzung einer zweiten Kopie von CcmCD beigetragen hat, die zu den beobachteten asymmetrischen Komplexen führte.

a Einzelpartikelrekonstruktion und schematische Darstellung des für die E154QA-Variante isolierten Ccm(AB)2CD-Komplexes in der Vorderansicht (oben) und in der Draufsicht (unten). b An CcmC gebundenes Häm in einer Struktur eines Ccm(AB)2CD-Komplexes aus E. coli (PDB 7VFP). Färbung der Untereinheiten gemäß der Originalveröffentlichung. c Anordnung der flexiblen Schleife 5 in CcmC ohne (oben) und mit gebundenem Häm (unten, PDB 7VFP). d Neuorientierung von Helix hV und Schleife 5 in der AlphaFold2-Vorhersage (grün) relativ zur experimentellen Struktur mit gebundenem ATP (weiß). e Überlagerung der AlphaFold2-Vorhersage (grün) mit Häm, wie es in PDB 7VFP nur an H60 gebunden ist (schwarz). In der In-silico-Vorhersage macht die Position von H184 es zu einem geeigneten distalen axialen Liganden für das Häm-Eisen. f Das Vier-Helix-Bündelmotiv um die WxWD-Schleife in CcmC in der ATP-Komplexstruktur, gefärbt vom N- zum C-Terminus in einem Regenbogenfarbverlauf.

Auf der extrazellulären Seite der Membran war der Unterschied zwischen dem offenen und geschlossenen Zustand von CcmAB minimal, und keine der Konfigurationen zeigte einen „nach außen offenen“ Zustand oder wies eine offensichtliche Bindungsstelle für ein Frachtmolekül auf. Im Gegensatz dazu impliziert die beobachtete Konformationsänderung des äußeren Protomers von CcmB im ATP-gebundenen Zustand oder im E154QA-Variantenkomplex (Abb. 3a), dass ein benachbartes CcmC-Protomer entweder vom Komplex dissoziieren oder als Reaktion seine eigene Konformation ändern müsste (Abb. 2h, Zusatzfilm 2). In CcmC bildet das Häm-handhabende Motiv 119WGTWWVWD126 die Schleife, die die Helices hIII und hIV verbindet (Abb. 1f). In unseren Strukturen von CcmC und auch in den kürzlich veröffentlichten19 waren diese Helices dicht beieinander gepackt und die WxWD-Schleife zeigte zur Vorderseite des Komplexes. In den berichteten Strukturen eines Ccm(AB)2CD-Komplexes mit gebundenem Häm (PDB 7F04 und 7VFP) war die Position der Helices ähnlich, aber die Häm-Cofaktoren waren an CcmC auf der Rückseite des Komplexes gebunden (Abb. 3b). Insgesamt stimmen die Häm-gebundenen Strukturen 7F04 und 7VFP mit dem hier beschriebenen symmetrischen Ccm(ABCD)2-Komplex mit einer quadratischen Mittelwertverschiebung von nur 3,8 Å für alle Atome überein, die Konformationen der einzelnen Untereinheiten sind jedoch ähnlicher nur 0,6 Å rmsd für CcmC, unabhängig von der Anwesenheit eines gebundenen Häms. Die WxWD-Schleife steht nicht in Kontakt mit der Hämgruppe und bleibt nahezu völlig unverändert. Das Gleiche wurde für Schleife 5 beobachtet, den teilweise ungeordneten, ausgedehnten Proteinabschnitt, der die Helices hV und hVI von CcmC verbindet (Abb. 3c). Während diese Schleife in keiner der beiden Strukturen vollständig aufgelöst wurde, sind die Positionen der beiden Histidine von CcmC, die Häm binden, H60 und H184, weitgehend identisch. In 7F04 koordiniert nur H60 das Hämeisen, während H184 in Richtung CcmB zeigt (Abb. 3c).

Anschließend führten wir verschiedene Strukturvorhersagen des CcmABCD-Komplexes mit AlphaFold2 im Multimermodus durch24. Die vorhergesagten Strukturen stimmten sehr gut mit den experimentellen überein, wiesen jedoch mehrere potenziell relevante Unterschiede auf. Einzelne AlphaFold2-Läufe lieferten nahezu identische Vorhersagen für einzelne Untereinheiten, sodass sich diese Analyse auf die größte Anordnung, einen symmetrischen Ccm(ABCDE)2-Komplex, konzentriert (Abb. 3d). Das Modell hatte den Kern-ABC-Transporter Ccm(AB)2 in einem geschlossenen Zustand, der dem ATP-gebundenen E154QA-Variantenkomplex sehr ähnlich war. Allerdings ragten in der symmetrischen Anordnung die Helices hI und hV der CcmB-Untereinheiten nicht nach außen, sodass das AlphaFold2-Modell dieses Schlüsselmerkmal der experimentellen Strukturen im geschlossenen Zustand nicht reproduzierte. Die vorhergesagte CcmC-Untereinheit unterschied sich am stärksten von der in allen experimentellen Strukturen (ergänzende Abbildung 5), und neben einer Verschiebung der WxWD-Schleife um etwa 1, 5 Å war dieser Unterschied hauptsächlich auf eine starke Neigung der periplasmatischen Hälfte der Helix zurückzuführen hV von CcmC (Abb. 3d). Bei dieser Neigung faltete sich die verlängerte Schleife 5 in Richtung CcmC, was zu einer Verschiebung von H184 um 18 Å von seiner Position nahe CcmB in den experimentellen Strukturen führte (Abb. 3e). Obwohl die AlphaFold2-Vorhersagen derzeit keine Cofaktoren einschließen, lagen die beiden zuvor als axiale Häm-Liganden identifizierten Histidine H60 und H184 direkt nebeneinander und wären gut geeignet, Häm gemeinsam zu ligieren, das auf ähnliche Weise wie in Struktur 7F04 gebunden ist ( Abb. 3f)23. Eine AlphaFold2-Vorhersage nur für die CcmC-Untereinheit zeigte genau die gleiche Konformation, was unterstreicht, dass diese Vorhersage nicht auf der Bildung eines Komplexes mit CcmB basiert. Darüber hinaus bildete H184 nun eine Wasserstoffbrücke von seinem Nδ1-Atom zum β-Carboxylat von D126 des WxWD-Motivs (Abb. 3e). Die AlphaFold-Vorhersage für CcmC kann auch direkt mit der experimentellen Struktur einer offenen Konformation der System-II-Häm-Lyase CcsBA aus Helicobacter hepaticus29 verglichen werden. In dieser Struktur (PDB 7S9Y) bindet Häm an der periplasmatischen Seite des integralen Membranproteins, mit H761 und H897 als axialen Liganden (ergänzende Abbildung 5e). Wie bereits erwähnt33,34, hat die Familie der Häm-handhabenden Proteine ​​einen gemeinsamen Faltungskern, und die Helices hII-hV von CcmE stimmen gut mit den Helices hIX-hXII der 13-TM-Helix-CcsBA-Lyase29 und mit den Helices hV-hVIII von überein CcmF (Ergänzende Abbildung 5c)18. Der zentrale Teil dieses aufeinanderfolgenden Vier-Helix-Bündels, Schleife 2 (die die zweite und dritte Helix verbindet) auf der periplasmatischen Seite der Membran enthält das WxWD-Motiv, während sich die axialen Histidinliganden für den Häm-Cofaktor in der ersten Helix befinden bzw. in Schleife 4. Die Domäne öffnet sich zur periplasmatischen Seite, und hier ist die gebundene Hämgruppe in den Strukturen von CcsBA (PDB 7S9Y) und CcmC (PDB 7F04) verankert. Beachten Sie, dass Häm in CcsBA vermutlich durch einen Kanal transportiert wird, der von den N-terminalen Helices des Proteins gebildet wird (ein separates CcsB-Protein in anderen Organismen), und dass in CcmF die Hämabgabe vom Chaperon CcmE wahrscheinlich über ein seitliches Tor im C erfolgt -terminaler Teil von CcmF18. In beiden Fällen erreicht der Cofaktor die andere Seite des WxWD-Motivs, das dann durch aromatische Stapelung mit seinen Tryptophanresten den Porphyrinring greifen könnte. All dies steht im Einklang mit einer konsistenten Funktion des WxWD-Motivs, die Hämgruppe um etwa 90° zu drehen und in die Halteposition zu bewegen, die in den beiden oben diskutierten Strukturen beobachtet wurde, sodass ihre 8-Vinylgruppe in Richtung Periplasma zeigt. Da die Lyase die kovalente Verbindung zum Cofaktor herstellt, wird diese 8-Vinyl-Gruppe zuerst vom zweiten Cystein eines Häm-bindenden Motivs im Apocytochrom angegriffen, während CcmE in System I über seine 3-Vinyl-Gruppe an Häm gebunden ist35,36 . Für die vorliegende Analyse des Ccm(ABCD)2-Komplexes deutet dies darauf hin, dass das Häm in Struktur 7F04 auch in einer Bindungstasche beobachtet wird, die es erreicht, nachdem es durch das WxWD-Motiv geleitet wurde. Aus diesem Grund liegen die Helices hIII und hIV von CcmC, die dieses Motiv verbindet, in allen bekannten Strukturen der Häm-handhabenden Kerndomäne zu nahe beieinander, was eine Konformationsumlagerung während der Häm-Handhabung impliziert (siehe Diskussion).

Das zur Herstellung des E. coli-CcmABCD-Komplexes verwendete Konstrukt enthielt auch das ccmE-Gen, das für das Häm-Chaperon CcmE kodiert, das den Cofaktor vom CcmABCD-Komplex empfängt und ihn zum Häm-Lyase-Komplex CcmFH(I) transportiert37,38. CcmE ist ein monotopes Membranprotein mit einer periplasmatischen β-Barrel-Domäne, das zuvor durch NMR-Spektroskopie 16,39 charakterisiert wurde und die Hämgruppe, die es vom CcmABCD-Komplex erhält, kovalent über das konservierte H130 an seinem C-Terminus bindet, während Rest Y134 vorgeschlagen wurde als axialer Ligand dienen15,38. In unseren Kryo-EM-Einzelpartikeldaten des nativen Komplexes enthielten die beiden am höchsten aufgelösten 3D-Klassen den Ccm(ABCD)2-Komplex (ergänzende Abbildung 3), aber eine davon wies zusätzlich eine prominente periplasmatische Domäne auf, die nach der Verfeinerung modelliert wurde als CcmE mit seiner N-terminalen Transmembranhelix (Abb. 4a). Diese Helix interagierte ausschließlich mit der Helix hVI von CcmB, wobei sich die periplasmatische Domäne von CcmE über der CcmBC-Schnittstelle auf einer Seite des Komplexes befand (Abb. 4b, Zusatzfilm 3). Obwohl die beobachtete Grenzfläche klein war, wurde die Wechselwirkung von CcmB mit CcmE in den Karten gut aufgelöst. 29 % aller für die endgültige Verfeinerung verwendeten Partikel enthielten CcmE, und obwohl bei niedrigeren Konturebenen eine zweite Kopie des Chaperons auf der gegenüberliegenden Seite des Komplexes sichtbar war und die N-terminale Helix von CcmE in Rekonstruktionen mit niedrigerer Auflösung sichtbar war Datenverarbeitung (Abb. 4c) enthielt die relevante Klasse überwiegend eine einzelne Kopie von CcmE mit etwas geringerer lokaler Auflösung (ergänzende Abb. 3) und vermutlich unterstöchiometrischer Belegung. Die Transmembranhelix von CcmE wurde vom Rest N2 bis S32 modelliert und wird von einem kurzen, flexiblen Scharnier gefolgt, das der β-Barrel-Domäne vorangeht, die bei F37 beginnt. Die Häm-koordinierenden Reste H130 und Y134 waren der Membran zugewandt, befanden sich jedoch über CcmB und nicht über CcmC (Abb. 4b). Auch die Assoziation von CcmE mit dem Komplex schien seine Struktur nicht zu beeinflussen, und bei CcmB wurde keine erkennbare Veränderung beobachtet.

eine 3D-Klasse aus dem Wildtyp-Datensatz, die gebundenes CcmE in der Vorderansicht (oben) und in der Draufsicht (unten) enthielt. b Position von CcmE auf der Rückseite des Komplexes, wobei die TM-Helix von CcmE in ausschließlichem Kontakt mit der Helix hIV von CcmB steht. c Zentraler Schnitt durch eine 3D-Klasse von CcmABCDE mit niedriger Auflösung (8 Å), der die Transmembranhelices des Komplexes und ihre Zuordnung zu Untereinheiten zeigt. Beachten Sie, dass die zusätzliche TM-Helix von CcmE auf beiden Seiten des Komplexes sichtbar ist. d AlphaFold2-Modell eines Ccm(ABCDE)2-Komplexes, in guter Übereinstimmung mit den experimentellen Daten (ergänzende Abbildung 7). e Der Hauptunterschied zwischen der experimentellen Struktur und dem AlphaFold2-Modell besteht in der Positionierung der periplasmatischen Domäne von CcmE, die in der Vorhersage um 90° in Richtung CcmC gedreht ist. f Detail der CcmCE-Schnittstelle der AlphaFold2-Vorhersage. Die mutmaßlichen Hämliganden H60 und H184 liegen nebeneinander (Abb. 3e), und H130 und Y134 von CcmE, die an der Hämbindung beteiligt sind, befinden sich in der Nähe der Hämbindungsstelle.

AlphaFold2 ergab ein Modell eines symmetrischen Ccm(ABCDE)2-Komplexes (Abb. 4d) mit einer quadratischen Abweichung von der experimentellen Struktur von 3,1 Å für alle Atome (ergänzende Abb. 7), das auch die beobachtete Assoziation von CcmE reproduzierte sehr gut zum heterooctameren Kern. In der Vorhersage banden zwei Kopien von CcmE peripher an CcmB, und der Bindungsmodus für die N-terminale Helix von CcmE stimmte genau mit dem in unserer Kryo-EM-Analyse beobachteten überein. Dies war angesichts der schwachen und möglicherweise vorübergehenden Wechselwirkung von CcmE mit CcmC nicht unbedingt zu erwarten. Die periplasmatische Domäne von CcmE wurde jedoch um etwa 90° in Richtung CcmC gedreht, wodurch sie über Schleife 5 und dem WxWD-Motiv der letzteren platziert wurde (Abb. 4e). Im AlphaFold-Modell ist der Häm-empfangende Rest H130E auf W119C des erweiterten WxWD-Motivs gestapelt (Abb. 4f), in einer Position, die sehr gut geeignet ist, die Hämgruppe anzugreifen, wenn er gebunden ist, wie in PDB 7F04 zu sehen (Abb. 3e, Zusatzfilm). 3). In der experimentellen Struktur zeigte die periplasmatische Domäne von CcmE eine erhöhte Mobilität und eine geringere lokale Auflösung als der Kernkomplex, was in Abwesenheit einer gebundenen Hämgruppe nicht überraschend ist. Gemäß der Rolle von CcmE in unserem Bojenmodell des Hämtransports von der Ccm(ABCD)2-Translokase zur CcmFGH(I)-Lyase ist Holo-CcmE nicht erforderlich, um eine starre Konformation zu erreichen, da der Häm-Cofaktor nie vollständig extrahiert wird die Membran18.

Die hier berichteten offenen und geschlossenen Konformationen von CcmABCD bestätigen die jüngsten Arbeiten von Li und Mitarbeitern19, unterscheiden sich jedoch in mehreren Aspekten möglicherweise funktioneller Relevanz. Am offensichtlichsten ist, dass wir einen heterooctameren Ccm(ABCD)2-Komplex als vorherrschende Spezies im nukleotidfreien Zustand isoliert haben, während die zuvor beschriebenen Strukturen durchweg nur jeweils eine Kopie von CcmC und CcmD enthielten. Die Gründe für diesen Unterschied sind nicht offensichtlich. Beide Gruppen klonierten ein polycistronisches, genomisches DNA-Fragment von E. coli mit einem hinzugefügten N-terminalen Affinitätstag an CcmA und lösten die Membranfraktion mit 1 % DDM auf. In unserem Fall wurde ein StrepTag(II) verwendet und die Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung aufgeschlossen, während Li und Mitarbeiter einen Hexa-Histidin-Tag und einen Mikrofluidizer für die Zelllyse verwendeten. Unsere Zentrifugationsschritte waren kürzer und wir haben das Waschmittel durch das synthetische Digitonin-Analogon Glyco-Diosgenin (GDN) ersetzt, aber ansonsten waren beide Ansätze ähnlich und schienen kompatibel zu sein, was die Frage aufwirft, welche Stöchiometrie physiologisch korrekt ist. Wir halten es für wahrscheinlicher, Untereinheiten zu verlieren, als sie zu gewinnen, doch mangels weiterer Beweise ist dies kein starker Punkt. Allerdings haben wir bei der Analyse der E154QA-Variante unerwartet auch einen Ccm(AB)2CD-Komplex erhalten, dem die ATP-Hydrolyse fehlt und der zu einem geschlossenen Zustand des ABC-Transportermoduls führt. Die Schließung des dimeren Transporters induzierte eine Konformationsänderung der Helices hI und hV in nur einem Monomer des CcmB-Dimers, die nicht mit dem beobachteten Bindungsmodus von CcmC an CcmB (Abb. 2h) kompatibel ist, wie auf der zytoplasmatischen Seite der Membran Die Helix hV von CcmB wurde nach außen gedrückt, was zu einer Kollision mit der Helix hIV von CcmC führte (Abb. 2h). Es scheint möglich, dass eine solche Umlagerung zum effektiven Ausstoß des CcmCD-Moduls aus dem Komplex führt, und es ist ziemlich bemerkenswert, dass sie nur in einem Protomer des CcmB-Dimers auftritt, während das andere seine offene Konformation mit CcmCD fast vollständig beibehält an Ort und Stelle. Beachten Sie jedoch, dass alle Analysen mit solubilisierten Membrankomplexen durchgeführt wurden, sodass ein wichtiger Aspekt einer biologischen Membran verloren geht, der laterale Druck der Lipiddoppelschicht. Dieses Merkmal wurde am ausführlichsten im Zusammenhang mit mechanosensitiven Kanälen40 diskutiert, ist jedoch eine allgemeine Eigenschaft, die von der Lipidzusammensetzung und der Form der Membran abhängt. Der Verlust des seitlichen Membrandrucks in einer Detergensmicelle kann durchaus zu einer Destabilisierung des CcmABCD-Komplexes führen, was zur Dissoziation einer CcmCD-Einheit führt. Wenn ja, was passiert dann in einer natürlichen Umgebung, in der die Membran einen Oktamerkomplex intakt halten kann? Wenn CcmC nicht dissoziiert, muss es sich der hervorstehenden Helix hV von CcmB anpassen, indem es seine eigene Helix hIV verschiebt (Abb. 2h). Diese Helix ist mit der benachbarten Helix hIII auf der periplasmatischen Seite über die Schleife verbunden, die das WxWD-Motiv enthält, und damit der Häm-Cofaktor, der von diesem Motiv verwaltet wird, von der Vorder- zur Rückseite von CcmC gelangt, wie oben vorgeschlagen, ist der Abstand dazwischen Diese beiden Helices von CcmC müssen vorübergehend zunehmen. Die Neuanordnung von Ccm(AB)2 beim Schließen könnte genau die treibende Kraft liefern, die zum Auslösen dieser Ereignissequenz erforderlich ist. Dies impliziert die Existenz einer zweiten Konformation von CcmC, die bisher unbeobachtet bleibt und aufgrund ihrer vorübergehenden Natur möglicherweise schwer zu identifizieren ist. In dieser Konformation könnte Häm zwischen den beiden Helices und unter der WxWD-Schleife passieren, wahrscheinlich eingeklemmt durch die beiden Tryptophan-Seitenketten der letzteren. Dabei wird der Cofaktor gedreht und seine geladenen Propionatseitenketten zur Membran hin gedreht. Diese Positionierung sollte in der hydrophoben Umgebung der Membran ungünstig sein, aber in CcmC ist das Häm in seiner Bindungsposition bereits leicht aus der Membran herausgehoben, wobei eine Propionatseitenkette eine Salzbrücke zu Arginin R128 bildet. Die Rotation der Hämgruppe ist von grundlegender Bedeutung, da sowohl CcmE im Häm-Translokase-Komplex als auch das Apopeptid im Lyase-Komplex die Vinylseitenketten angreifen müssen, die in der energetisch günstigsten Ausrichtung des Cofaktors tief in der Membran verborgen wären lipiddoppelschicht.

In ihrem aktuellen Manuskript schreiben Li et al. beschreiben CcmABCD als einen „Häm-Freisetzungskomplex“, was bedeutet, dass die freie Enthalpie der ATP-Hydrolyse genutzt wird, um das Fracht-Häm kovalent an CcmE zu binden und es aus der Membran auszustoßen19. Dies basiert auf der etablierten Erkenntnis, dass ein CcmCDE-Komplex Häm auch in Abwesenheit von CcmAB kovalent an das Chaperon CcmE17,37 bindet. Die bislang unbeobachtete, vorübergehende Konformation von CcmC, die wir auf der Grundlage der obigen Überlegungen vorschlagen, wäre jedoch eine, bei der der Cofaktor direkt mit dem WxWD-Motiv in CcmC interagieren kann. Aufgrund der Analogie zu CcmF und CcsBA sollte dies geschehen, bevor die Hämgruppe die in den Ccm- und Ccs-Strukturen beobachtete Bindungstasche erreicht (ergänzende Abbildung 5). In diesem Modell dient die ATP-Hydrolyse dazu, die Konformation von CcmC so zu ändern, dass seine Helices hIII und hIV weit genug voneinander entfernt sind, damit eine Hämgruppe unter die WxWD-Schleife geführt und gedreht werden kann, damit H130E an die 3-Vinylgruppe binden kann. Beide Hypothesen sind nicht widersprüchlich: Der Transport eines Häm-Cofaktors zum und durch das WxWD-Motiv kann durchaus mit der Ausstoßung eines anderen Häm-Cofaktors koordiniert sein, der bereits aus dem vorherigen Zyklus an der Bindungsstelle vorhanden ist, und die ATP-Hydrolyse würde dann tatsächlich auch diesen ausstoßen Cofaktor nach seiner Anbindung an CcmE. Die entscheidende Frage ist, wo sich die Hämgruppe befindet, bevor sie mit dem WxWD-Motiv von CcmE interagiert. Freies Häm verteilt sich leicht in eine biologische Membran, wobei die geladenen Propionatgruppen zur Membran-Wasser-Grenzfläche ausgerichtet sind18. Wie jedes Amphiphil verfügt der Cofaktor über eine gute seitliche Beweglichkeit innerhalb der Lipiddoppelschicht, steht jedoch einer hohen Energiebarriere gegenüber, damit die Propionate vom inneren zum äußeren Blättchen gelangen können, so dass Flip-Flop-Ereignisse selten sind. Wir schlagen vor, dass es dieser Schritt ist, bei dem der Ccm(ABCD)2-Komplex ins Spiel kommt, der als Floppase fungiert, die eine Hämgruppe vom inneren zum äußeren Blättchen transloziert und sie dann durch die WxWD-Schleife an CcmE weiterleitet. Wie die CcmAB-Knockout-Studien gezeigt haben, scheint dies nicht unbedingt erforderlich zu sein und es wird immer noch ein arretierter CcmCDE-Komplex gebildet17,37, aber dies würde nur winzige Mengen an Häm erfordern, die in der äußeren Packungsbeilage vorhanden sind, was durchaus über andere Wege erreicht werden kann oder spontan auftreten. Phylogenetisch gruppiert sich CcmAB mit anderen ABC-Transportern, die als Floppasen fungieren, mit bekannten Strukturen für den O-Antigen-Transporter Wzm-Wzt41 und den Teichonsäure-Exporter TarGH42. Wir sollten diese Analogie jedoch nicht überbewerten, da in dem von uns vorgestellten Modell die Ladung nicht über das CcmB-Dimer, sondern entlang der CcmBC-Schnittstelle transportiert würde. Dies ist bei anderen bekannten Floppasen nicht der Fall, und obwohl wir nicht ausschließen können, dass das CcmB-Dimer eine bislang unbekannte, nach außen offene Konformation aufweist, stimmt die Summe unserer Daten besser mit einem Translokationsmodus überein, an dem CcmC und sein WxWD-Motiv beteiligt sind . Wir weisen außerdem auf die Analogie zur Lipid-Scramblase nhTMEM16 hin, bei der der Lipidtransport auch entlang einer äußeren Furche des integralen Membranproteins erfolgt, das ansonsten als Chloridkanal dient43.

Ccm(ABCD)2 nutzt die Energie der ATP-Hydrolyse, um Hämgruppen vom inneren zum äußeren Blättchen der Membran zu transportieren, und sorgt so dafür, dass ein zellulärer Pool seitlich beweglicher CcmE-Chaperone, die mit Cofaktoren beladen sind, bereit für die Assoziation mit der Lyasekomponente CcmFGH bleibt (I) für die kovalente Bindung seiner Ladung an ein Apocytochrom-Bindungsmotiv. Als solches stellt es einen wesentlichen Teil dieser komplexen posttranslationalen Modifikationsmaschinerie dar, aber die Frage, warum System-II-Hämaturasen des Ccs-Systems auf diesen Mechanismus verzichten können, muss noch beantwortet werden. Bemerkenswerterweise kommen sie in Organismen vor, deren Genom reich an Cytochrom c ist, und die verfügbaren Strukturdaten deuten darauf hin, dass diese Lyasen auch das laterale Tor zum äußeren Blättchen besitzen, das wir in CcmF beobachtet haben und das als Ort der Häm-Insertion durch CcmE18 vermutet wird. Derzeit müssen noch zentrale Fragen beantwortet werden, aber das Bild, das bei Häm-Maturase-Anordnungen immer mehr in den Fokus rückt, ist das einer auffallend mechanischen, posttranslationalen Modifikationsmaschinerie, die aus unabhängigen, beweglichen Teilen besteht, die durch Konformationsänderungen koordiniert werden, die durch das Zytoplasma gesteuert werden ATP-Hydrolyse und zelluläre Redoxprozesse.

Das ccm-Operon von Escherichia coli wurde aus dem Cytochrom-C-Reifungshelferplasmid pEC8621 amplifiziert und in einen pASK-IBA-Vektor (IBA Lifesciences) kloniert, wodurch ein N-terminaler StrepTag(II) (WSHPQFEK) in das Genprodukt von ccmA eingeführt wurde. Rekombinante Ccm-Komplexe wurden in den E. coli-Stämmen BL21(DE3) oder C43(DE3)44 hergestellt. Die Kulturen wurden in TB-Medium bei 37 °C und 180 U/min Rühren gezüchtet, bis die OD600 1–2 erreichte, dann wurde die Proteinproduktion durch Zugabe von 0,2 µg·mL–1 Anhydrotetracyclin gestartet und die Temperatur auf 20 °C gesenkt. Nach 14–16 Stunden Induktion wurden die Kulturen durch Zentrifugation bei 5000 × g und 4 °C (Avanti J-26 XP, Beckman Coulter) geerntet. Die Zellpellets wurden in Lysepuffer mit 50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 300 mM NaCl resuspendiert und durch Ultraschall (Branson-Ultraschallgerät 450 W, 70 % Amplitude, 3 s Betrieb und 10 s Pause) aufgeschlossen. Die Rohextrakte wurden dann 30 Minuten lang bei 4 °C und 30.000 × g zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen, und die Überstände wurden 1 Stunde lang bei 4 °C und 300.000 × g weiter ultrazentrifugiert, um die Membranfraktion zu sedimentieren. Die Membranpellets wurden in 8 ml Lysepuffer pro Gramm Membranen resuspendiert, mit 1 % n-Dodecyl-β-D-maltopyranosid (DDM) 1 Stunde lang solubilisiert und durch 30-minütige Zentrifugation bei 100.000 × g geklärt. Die Überstände wurden auf eine Strep-Tactin Superflow-Hochkapazitätssäule (IBA Lifesciences, 5 ml Bettvolumen) geladen, die in Lysepuffer mit 0,01 % DDM äquilibriert war. Nach dem Waschen wurden die Proteinkomplexe mit Lysepuffer, der 5 mM D-Desthiobiotin enthielt, eluiert, durch Ultrafiltration konzentriert und durch Gelfiltration unter Verwendung von HiLoad Superdex 200 16/600 (GE Healthcare), äquilibriert in SEC-Puffer (20 mM Tris/HCl pH), weiter gereinigt 7,5, 150 mM NaCl, 0,01 % DDM oder 0,02 % GDN). Während des Affinitätsreinigungsschritts wurde ein Detergensaustausch gegen Glykodiosgenin (GDN) durchgeführt. Die gereinigten Komplexe wurden konzentriert und mittels SDS-PAGE weiter analysiert. Die Polypeptidbanden auf der SDS-PAGE wurden durch Massenspektrometrie (Toplab) identifiziert. Alle Bakterienstämme, Plasmide und Primer sind in der Ergänzungstabelle 2 zusammengefasst.

Die Proben von CcmABCDE (GDN) und Ccm(E154QAB)2CD in einer DDM-Micelle wurden nach der Gelfiltration auf 10 mg·mL–1 konzentriert, auf glimmentladene Quantifoil R 2/1-Gitter auf 300-Kupfer-Mesh aufgetragen und 5 s lang inkubiert , 2 s lang mit Filterpapier abgetupft und in flüssigem Ethan, gekühlt mit flüssigem Stickstoff, unter Verwendung eines Vitrobot Mark III (Thermo Fisher) bei 90 % Luftfeuchtigkeit und einer Temperatur von 10 °C schockgefroren. Der Datensatz für CcmABCDE in GDN wurde mit SerialEM45 auf einem 200-kV-Glacios-Kryotransmissionselektronenmikroskop (Thermo Fisher) erfasst, das mit einem Gatan K3-Direktelektronendetektor mit einer Pixelgröße von 0,87 Å·px−1, 30 Bildern und einer Belichtung ausgestattet war Zeit von 4 s, mit einer Gesamtdosis von 50 e–·Å–2. Der Datensatz für Ccm(E154QAB)2CD in DDM wurde mit einem 300-kV-Titan-Krios-TEM (Thermo Fisher) erfasst, das mit einem Gatan-K2-Detektor bei einer Pixelgröße von 0,82 Å·px−1, 30 Bildern und einer Belichtungszeit von ausgestattet war 4 s, mit einer Gesamtdosis von 50 e–·Å–2.

Der detaillierte Arbeitsablauf für die Datenverarbeitung ist in den ergänzenden Abbildungen zusammengefasst. 3 und 6. Für den CcmABCDE (GDN)-Datensatz wurden die Rohfilmstapel mit Relion46 bewegungskorrigiert und die Defokussierungswerte pro Mikrograph wurden mit CTFFIND v4.147 geschätzt. Die anfängliche Partikelauswahl erfolgte mit einer Laplace-of-Gaussian-Blob-Erkennung, gefolgt von einer vorlagenbasierten Auswahl in Relion. Die extrahierten Partikel wurden dann mehreren Runden der 2D-Klassifizierung unterzogen und als gut ausgewählte Partikel wurden zur Erstellung eines ersten 3D-Modells verwendet. Nach der 3D-Klassifizierung zeigten zwei Klassen eine gut aufgelöste Dichte für Sekundärstrukturmerkmale, wobei eine scheinbare zweifache Symmetrie auf die Ccm(ABCD)2-Anordnung hinweist. Eine 3D-Klasse zeigte auch eine zusätzliche Dichte für CcmE und wurde nach CTF-Verfeinerung und Bayes'scher Politur48 in Relion und ungleichmäßiger Verfeinerung49 in CryoSPARC50 auf eine Auflösung von 3,81 Å verfeinert. Partikel dieser beiden 3D-Klassen wurden ebenfalls kombiniert und mit C2-Symmetrie positioniert, um eine höhere Auflösung von 3,47 Å für den Ccm(ABCD)2-Komplex zu erreichen.

Der Datensatz für CcmE154QABCD (DDM) wurde mit CryoSPARC50 verarbeitet. Die Patch-Bewegungskorrektur und die CTF-Schätzung wurden vor der Partikelauswahl mithilfe des Blob-Pickers durchgeführt. Die ausgewählten 2D-Klassen wurden als Eingabe für die Vorlagenauswahl verwendet. Nach der zweiten Runde der 2D-Klassifizierung wurden ausgewählte 2D-Klassen für eine Ab-initio-Rekonstruktion verwendet. Mehrere Runden heterogener und ungleichmäßiger Verfeinerung verbesserten die endgültige Kartenauflösung auf 3,94 Å mit einer Zusammensetzung von Ccm(E154QAB)2CD. Ein zweiter Datensatz für CcmE154QABCD (GDN) mit 2,5 mM ATP wurde analog verarbeitet, wobei die endgültige Kartenauflösung 3,62 Å betrug. Als Schätzung der Kartenauflösung wurde das Goldstandard-Fourier-Shell-Korrelationskriterium (FSC) von 0,143 verwendet (ergänzende Abbildung 6). Kryo-EM-Karten wurden mit UCSF ChimeraX52 visualisiert.

Ein Startmodell für jede Untereinheit von CcmABCDE wurde von SWISS-MODEL53 generiert und mit ChimeraX52 starr in die Dichtekarten eingepasst. Der Modellaufbau wurde manuell in Coot54 durchgeführt. Nach der Veröffentlichung von AlphaFold224,55 wurde ein von diesem Algorithmus abgeleitetes CcmE-Modell verwendet, um die Ccm(ABCD)2E-Karte anzupassen. Für alle Berechnungen wurde eine lokale Installation von AlphaFold 2.1 auf einem GPU-Server verwendet. Verbesserungen der ursprünglichen Modelle wurden mit Realraumverfeinerung in PHENIX56 durchgeführt, die Qualität der Struktur wurde durch MolProbity57 validiert. Die Statistiken zur Datenerfassung und -verfeinerung sind in der Ergänzungstabelle 1 zusammengefasst. Die Zahlen wurden mit PyMOL (Schrödinger LLC) oder UCSF ChimeraX52 generiert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Dichtekarten und Atomkoordinaten wurden bei der Protein Data Bank (PDB) unter http://www.pdb.org hinterlegt. Die Kryo-EM-Dichtekarten wurden auch bei der Electron Microscopy Data Bank (EMDB) hinterlegt. Die Zugangsnummern sind: Ccm(ABCD)2: PDB 8CE1 und EMD-16597, (Ccm(ABCD)2E): PDB 8CE8 und EMD-16601, (Ccm(E154QAB)2CD): PDB 8CEA und EMD-16602 und (Ccm (E154QAB)2CD mit ATP): PDB 8CE5 und EMD-16599.

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Das pEC86-Plasmid war eine großzügige Spende von Linda Thöny-Meyer. Diese Arbeit wurde vom Europäischen Forschungsrat (Fördernummer 310656) (OE) und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (CRC 1381, Projekt-ID 403222702, CRC 992, Projekt-ID 192904750 und RTG 2202, Projekt-ID 46710898) (OE) unterstützt. Wir danken M . Chami für die hervorragende Unterstützung bei der Datenerfassung im BioEM-Labor des Basler Biozentrums. Wir danken außerdem dem bwHPC-Cluster des Landes Baden-Württemberg und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Förderung INST 35/134-1 FUGG) für die rechnerische Unterstützung.

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Institut für Biochemie, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, 79104, Freiburg im Breisgau, Germany

Lorraine Ilcu, Lukas Denkhaus, Anton Brausemann, Lin Zhang & Oliver Einsle

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LI, AB, LZ und OE entwarfen die Experimente, LI, LD und LZ führten die Experimente durch, LI, LZ und OE verarbeiteten Daten, LI und LZ erstellten und verfeinerten das Strukturmodell und LI, LZ und OE schrieben das Manuskript .

Korrespondenz mit Lin Zhang oder Oliver Einsle.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Benjamin Orlando, Xiaodi Tang und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Ilcu, L., Denkhaus, L., Brausemann, A. et al. Architektur des Häm-translozierenden CcmABCD/E-Komplexes, der für die Reifung von Cytochrom c erforderlich ist. Nat Commun 14, 5190 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40881-y

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Eingegangen: 02. Februar 2023

Angenommen: 15. August 2023

Veröffentlicht: 25. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40881-y

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