Das iPSC | Gansu Calciumformiat Co., Ltd

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 789 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Cholesterin ist ein wesentlicher Membranstrukturbestandteil und Vorläufer von Steroidhormonen und an zahlreichen Signalprozessen beteiligt. Astrozyten regulieren die Cholesterinhomöostase im Gehirn und versorgen Neuronen mit Cholesterin. Der ATP-bindende Kassettentransporter A1 (ABCA1) ist der wichtigste Cholesterin-Efflux-Transporter in Astrozyten. Hier zeigen wir eine gestörte Cholesterinhomöostase in Astrozyten, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) von Männern mit fragilem X-Syndrom (FXS) erzeugt wurden, dem häufigsten Grund für eine angeborene geistige Behinderung. Die ABCA1-Spiegel sind in FXS-Astrozyten von Mensch und Maus im Vergleich zu Kontrollen verringert. Die Anreicherung von Cholesterin geht mit einem Anstieg von Desmosterol und mehrfach ungesättigten Phospholipiden im Lipidom von FXS-Maus-Astrozyten einher. Abnormale astrozytische Reaktionen auf Zytokinexposition sowie veränderte entzündungshemmende und Zytokinprofile des menschlichen FXS-Astrozytensekretoms lassen darauf schließen, dass Entzündungsfaktoren zur veränderten Cholesterinhomöostase beitragen. Unsere Ergebnisse zeigen Veränderungen im Lipidstoffwechsel der Astrozyten, die die Membraneigenschaften entscheidend regulieren und den Cholesterintransport in FXS-Astrozyten beeinflussen können, was ein Ziel für die Therapie bei FXS darstellt.

Cholesterin ist ein wesentlicher Strukturbestandteil biologischer Membranen und eine Vorstufe von Steroidhormonen1. Es ist für die Synapsenbildung und -funktion von entscheidender Bedeutung, da in Lipidflößen ein hoher Cholesteringehalt erforderlich ist2. Die Wechselwirkung von Cholesterin mit einer Reihe von Ionenkanälen kann die Kanalfunktion erleichtern oder hemmen und zur Regulierung der neuronalen Aktivität beitragen3,4. Die zelluläre Verteilung von Cholesterin wird durch seine Affinität zu Sphingolipiden und seine Abneigung gegenüber hochungesättigten Phospholipiden (PLs)5 bestimmt. Diese molekularen Wechselwirkungen fördern die Segregation von Membranmikrodomänen, die für die Funktionen vieler integraler Proteine und deren Wechselwirkungen als entscheidend angesehen werden1. Der Cholesterinpool des Gehirns ist von anderen Cholesterinpools des Körpers getrennt und sowohl Neuronen als auch Astrozyten synthetisieren Cholesterin im Gehirn6. Astrozyten produzieren überschüssiges Cholesterin und scheiden den Großteil des produzierten Cholesterins zur Verwendung durch Neuronen aus7. Der wichtigste Cholesterin-Effluxtransporter in Astrozyten ist der ATP-bindende Kassettentransporter A1 (ABCA1), der zelluläres Cholesterin und PLs auf lipidarme Apolipoproteine überträgt, die Cholesterin transportieren8,9,10.

Die Cholesterinhomöostase ist bei vielen Syndromen im Zusammenhang mit der Autismus-Spektrum-Störung (ASD), einschließlich des fragilen X-Syndroms (FXS), fehlreguliert11. FXS ist das häufigste angeborene Syndrom der geistigen Behinderung und die monogene Ursache von ASD12. FXS wird durch das Fehlen des Fragile-X-Messenger-Ribonukleoproteins (FMRP) verursacht, das für die normale Synapsenbildung und Plastizität unerlässlich ist13. Die Behandlung mit Lovastatin, einem Inhibitor der 3-Hydroxy-3-methylglutarylcoenzym A (HMG-CoA)-Reduktase, der den frühen irreversiblen und geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in der Biosynthese von Cholesterin reguliert, dämpft die neuronale Übererregbarkeit im Gehirn des FXS-Mausmodells Fmr1 KO Mäusen und rettet einen Teil des Maus-FXS-Phänotyps14. Eine frühe kurze Behandlung mit Lovastatin verhinderte auch assoziative Lerndefizite bei Fmr1-KO-Ratten15, aber Cholesterin wurde in den FXS-Modellen für Nagetiere nicht in Bezug auf die Reaktionen auf die Lovastatin-Behandlung gemessen.

In der ersten offenen Studie wurde festgestellt, dass die Behandlung mit Lovastatin die Alltagsfähigkeiten und die Kommunikationssubskalen bei Personen mit FXS verbessert16. Die Behandlungseffekte waren geringer, aber dennoch sichtbar, insbesondere wenn Lovastatin mit Minocyclin kombiniert wurde, auch in einer anderen Pilotstudie mit 22 Teilnehmern17. Allerdings steigerte Lovastatin in einer randomisierten, doppelblinden Studie nicht das Behandlungsansprechen einer von den Eltern durchgeführten Sprachintervention18, und es blieb unklar, ob Lovastatin einen geringeren Einfluss auf sprachbezogene Mechanismen hat als Mechanismen, die anderen Symptomen wie Hyperaktivität und Stereotypie bei FXS zugrunde liegen . Darüber hinaus können individuelle Unterschiede im FXS und der kombinierte Einsatz anderer Arzneimittel das Ergebnis klinischer Studien mit Lovastatin beeinflussen16. Personen mit FXS haben einen verringerten peripheren Cholesterin- und Triacylglycerinspiegel (TAG) sowie ein abnormales Fettsäureprofil (FA)19,20,21, was die Angemessenheit der Lovastatin-Behandlung in Frage stellt. Gehirnregionspezifische Veränderungen im Cholesterinstoffwechsel in einem FXS-Rattenmodell wurden mithilfe eines enzymatischen kolorimetrischen Cholesterintests gezeigt22. Darüber hinaus wirkt sich ein FMRP-Mangel auf die Lipidhomöostase aus23 und die Ergänzung mit mehrfach ungesättigten n-3-Fettsäuren (n-3 PUFA) hat positive Auswirkungen auf den Verhaltensphänotyp der Fmr1-KO-Mäuse24,25.

Angesichts der entscheidenden Rolle von Astrozyten bei der Aufrechterhaltung der Cholesterinhomöostase im Gehirn untersuchten wir den Cholesterinhaushalt in FXS-Astrozyten. Wir fanden heraus, dass die Expression von ABCA1 in FMRP-defizienten Astrozyten, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) stammen, die von FXS-Männchen erzeugt wurden, und aus den Kortizes von Fmr1-KO-Mäusen verringert war. Die gleichzeitig erhöhten Cholesterin- und Desmosterolspiegel in Astrozyten waren mit einer Membranumstrukturierung verbunden, die mehrfach ungesättigte PL-Spezies auf Kosten von Sphingomyelin- (SM) und Phosphatidylcholin- (PC) Spezies mit einem geringen Grad an Ungesättigtheit begünstigte. Wir untersuchten auch die Rolle des proinflammatorischen Status der FXS-Astrozyten bei der verringerten ABCA1-Expression und beobachteten ein dysreguliertes Zytokin-/Chemokin-Sekretomprofil und eine FXS-Astrozyten-Reaktivität als Reaktion auf Zytokine. Wir vermuten, dass präinflammatorische Zustände und eine veränderte Cholesterinhomöostase FXS-Astrozyten daran hindern können, die glia-neuronalen Interaktionen bei FXS zu beeinflussen.

ABCA1 überträgt zelluläres Cholesterin und PLs auf lipidarme Apolipoproteine, die verestertes Cholesterin transportieren9,10. Wir fanden heraus, dass die ABCA1-mRNA-Expression in menschlichen Vorderhirn-Astrozyten, die aus drei FXS-patientenspezifischen männlichen iPSC-Linien erzeugt wurden, im Vergleich zu Kontrollen verringert war (P = 0,011) (Abb. 1a). In ähnlicher Weise exprimierten aus menschlichen embryonalen Stammzellen (hESC) gewonnene FMR1-KO-Astrozyten in der RNA-Seq-Analyse weniger ABCA1 als ihre isogenen Kontrollen (log2 −6,41-fache Änderung, P = 0,0004, P-Anpassung = 0,125). Die ABCA1-Proteinexpression war auch in von FXS iPSC abgeleiteten Astrozytenkulturen verringert (P = 0,013; Abb. 1b, c).

a Expression von ABCA1-mRNA in menschlichen Kontroll- und FXS-Astrozyten; n(Kontrolle) = 3 Zelllinien und n(FXS) = 4 Zelllinien (3 biologisch unabhängige Zelllinien). b Immunfluoreszenzbilder, die ABCA1 (rot) und GFAP (grün) in Kontroll- und FXS-Astrozyten zeigen, Maßstabsbalken 50 μm. c Relative ABCA1-Proteinexpression in Kontroll- und FXS-Astrozyten; n(Kontrolle) = 241 Zellen und n(FXS) = 285 Zellen auf 3–4 Kulturen/jede Zelllinie (4 Kontroll- und 3 FXS-Zelllinien). d Relative Häufigkeit des Gesamtcholesterins im Astrozyten-konditionierten Medium (ACM) der Kontrolle (HEL23.3-, HEL24.3- und HEL46.11-Zelllinien von links nach rechts) und FXS (HEL69.6, HEL70.3, HEL70). .6- und HEL100.2-Zelllinien (von links nach rechts) Astrozyten unter Grundbedingungen und nach Behandlung mit Retinsäure (RA). e Relative Häufigkeit von Cholesterin und f-Cholesterinester in der Kontrolle und FXS-ACM in der LS-MS-basierten Lipidomics-Analyse; n(Kontrolle) = 3 Zelllinien und n(FXS) = 4 (3 biologisch unabhängige Zelllinien). Die gestrichelte Linie zeigt die Cholesterin- (e) und Cholesterinester- (f) Werte im zellfreien Medium. g Verhältnis der relativen Häufigkeit von Cholesterin/Cholesterinester in der Kontrolle und FXS-ACM unter Basisbedingungen. h Expression von FAT1P in menschlichen Kontroll- und FXS-Astrozyten; n(Kontrolle) = 3 Zelllinien und n(FXS) = 4 (3 biologisch unabhängige Zelllinien). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Zur Auswertung der statistischen Unterschiede wurde der zweiseitige t-Test angewendet; *P < 0,05.

Astrozyten produzieren Cholesterin auf Nachfrage von Neuronen und scheiden den größten Teil ihres Cholesterins aus7. Um den Einfluss einer verringerten Expression des astrozytären Cholesterintransporters auf die Cholesterinsekretion aus FXS-Astrozyten zu beurteilen, verglichen wir den Gesamtcholesteringehalt in konditioniertem Astrozytenmedium (ACM), das aus serumfreien menschlichen Astrozytenkulturen aus vier FXS- und drei Kontroll-iPSC-Linien gesammelt wurde. Wir beobachteten, dass sich der Cholesteringehalt zwischen FXS und Kontroll-ACM nicht unterschied (Abb. 1d). Die Exposition gegenüber Retinsäure (RA), die die Cholesterinsekretion durch Aktivierung des Leber-X-Rezeptors (LXR)-ABCA1-Signals erhöhen kann, hatte keinen messbaren Einfluss auf den extrazellulären Cholesterinspiegel in FXS- oder Kontroll-Astrozytenkulturen (Abb. 1d).

Mithilfe der Massenspektrometrie (MS) stellten wir fest, dass sich der Cholesterinspiegel zwischen FXS und Kontroll-ACM nicht signifikant unterschied (P = 0,093), obwohl es einen Trend gab, der auf einen Anstieg hindeutete (Abb. 1e). Es gibt Hinweise darauf, dass menschliche Astrozyten große cholesterinreiche Lipoproteine absondern und das meiste abgesonderte Cholesterin verestert ist (Cholesterinester, CE), im Gegensatz zu hauptsächlich nicht verestertem Cholesterin enthaltenden Lipoproteinen, die aus Maus-Astrozyten abgesondert werden27. Die CE-Mengen unterschieden sich nicht zwischen menschlichen FXS- und Kontrollproben unter Grundbedingungen oder nach Behandlung mit RA (P = 0,409 bzw. 0,945; Abb. 1f). Allerdings war das Verhältnis von Cholesterin zu CE in FXS-Sekretomen höher als in den Kontrollen (P = 0,029; Abb. 1g).

Die gespeicherten und sezernierten CE werden aus Cholesterin und langkettigem Fettacyl-CoA28 gebildet. Das vom SLC27A1-Gen kodierte FA-Transportprotein FAT1P besitzt Acyl-CoA-Synthetase-Aktivität und spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufnahme langkettiger FAs durch die Plasmamembran29. Ähnlich wie bei der ABCA1-Expression war SLC27A1 im Vergleich zu Kontrollen in FXS-iPSC-abgeleiteten Astrozyten reduziert (Abb. 1h). Herunterreguliertes FATP1 könnte das Lipidgleichgewicht beeinträchtigen, indem es die Aufnahme langkettiger FAs in FXS-Astrozyten verringert.

Die FXS-Spezifität der verringerten ABCA1-Expression im FXS-Astrozytenmodell des menschlichen Vorderhirns wurde durch die Beobachtung einer verringerten ABCA1-Immunreaktivität in kortikalen Astrozyten von Fmr1-KO-Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-(WT)-Kontrollen bestätigt (P = 0,034; Abb. 2a). Wie bei menschlicher ACM unterschieden sich die Cholesterinspiegel (P = 0,634; Abb. 2b) und CE (P = 0,202; Abb. 2c) bei ACM nicht von Fmr1-KO-Astrozyten im Vergleich zu WT unter Verwendung von MS. Unerwarteterweise wurde im positiven Ionenmodus in Fmr1 KO ACM im Vergleich eine erhebliche Abnahme von Desmosterol (367,3357 m/z; P = 0,030) (Abb. 2d), dem letzten Vorläufer von Cholesterin im ungesättigten Sterol-Seitenkettenweg von Bloch, beobachtet dazu in WT ACM.

a Relative ABCA1-Immunreaktivität in kultivierten Maus-WT- und Fmr1-KO-Astrozyten. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM; n = 48–57 Bilder, 4–5 Astrozytenkulturen pro Gruppe, isoliert aus P1-WT- und KO-Wurfgeschwistern. b Relative Cholesterinhäufigkeit, c relative Cholesterinesterhäufigkeit und d relative Desmosterolhäufigkeit in WT- und Fmr1-KO-Maus-Astrozyten-konditioniertem Medium (ACM) in LS-MS-basierter Lipidomics-Analyse. e Wärmekarte (Daten als Z-Scores dargestellt), die das Profil von Phosphatidylcholin (PC)-Spezies in WT und Fmr1 KO ACM in der LC-MS-Analyse zeigt. f Balkendiagramm der PC-Artenprofile, das auch die Werte für einzelne Proben anzeigt, und g Diagramm der Hauptkomponentenanalyse (PCA) der PC-Arten in WT und Fmr1 KO ACM. b–g Daten von Maus-ACM; Mittelwert ± SEM, n(WT) = 3 und n(Fmr1 KO) = 3 biologisch unabhängige Astrozytenkulturen. Zur Auswertung der statistischen Unterschiede wurde der t-Test angewendet; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Soft Independent Modeling of Class Analogies (SIMCA) bestätigte statistisch signifikante Unterschiede in der PC-Artenzusammensetzung in den WT- und Fmr1-KO-Mediumproben (P < 0,05).

Zusätzlich zu Cholesterin exportiert ABCA1 PC, Phosphatidylserin (PS) und SM aus dem Zytoplasma in das Exozytoplasma von Membranen, und seine ATPase-Aktivität wird insbesondere durch PC, PS und SM31 stimuliert. Wir fanden heraus, dass sich die Lipidprofile zwischen ACM aus Fmr1-KO- und WT-Maus-Astrozyten unterschieden und dass die Unterschiede in den Profilen von PC-Arten am deutlichsten zu sein schienen (Abb. 2e). Die Konzentrationen einfach ungesättigter PC-Spezies (z. B. 32:1 und 34:1) waren niedriger und es gab leichte Erhöhungen mehrfach ungesättigter PC-Spezies in Fmr1 KO ACM im Vergleich zu Kontrollen (Abb. 2f, ergänzende Abbildung 1). Diese PC-Unterschiede zeigten sich auch in der PCA-Analyse (Abb. 2g). Das veränderte PC-Profil von Fmr1-KO-ACM deutete darauf hin, dass das Fehlen von FMRP zu einer Fehlregulation des ABCA1-vermittelten Ausflusses von PC zusammen mit Cholesterin aus Fmr1-KO-Astrozyten führte.

Wir fanden heraus, dass reduziertes ABCA1 mit mehreren Veränderungen im Lipidom von Fmr1-KO-Astrozyten in der massenspektrometrischen Analyse verbunden ist. Die Cholesterinhäufigkeit war in Fmr1-KO-Astrozyten im Vergleich zu WT-Kontrollen erhöht (P = 0,038; Abb. 3a). Da das Gesamtcholesterin im Astrozytenmedium von Mensch und Maus durch den FMRP-Mangel nicht beeinflusst wurde, deuten die Daten auf eine Anreicherung von Cholesterin in Astrozyten hin. Allerdings deutete ein erhöhter Desmosterolspiegel in KO-Astrozyten (P = 0,036; Abb. 3b) bei gleichzeitig verringerter Desmosterolhäufigkeit in ACM auf eine höhere Aufnahme von Desmosterol durch Fmr1-KO-Mausastrozyten im serumhaltigen Medium hin. Da Desmosterol ein Vorläufer ist, der für die Cholesterinsynthese benötigt wird, spiegeln die Daten wahrscheinlich eine höhere Cholesterinsynthese durch Fmr1-KO-Maus-Astrozyten wider. Die Akkumulation von Desmosterol könnte auch als Versuch angesehen werden, die LXR-Signalisierung zu aktivieren und dadurch die Sterolsekretion aus Astrozyten zu erhöhen32,33.

a Relative Häufigkeit von Cholesterin und b Desmosterol in WT- und Fmr1-KO-Mausastrozyten. c Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) bewertet die Darstellung der Membranphospholipidspezies in WT- und Fmr1-KO-Mausastrozyten. d Wärmekarte der Membranlipide (Daten als Z-Scores dargestellt), die erhöhte Mengen mehrfach ungesättigter Phospholipidspezies und auch einige Spezies mit den kürzesten Ketten, aber arm an Phospholipiden mit einer oder zwei einfach ungesättigten Acylketten in WT-Kontrollen und Fmr1-KO-Astrozyten zeigt. e Phosphatidylcholin (PC)-Speziesprofile in WT- und Fmr1-KO-Astrozyten, auch mit Angabe der Werte für einzelne Proben. f Vulkandiagramm der Membran-Phospholipidspezies, die im Fmr1-KO im Vergleich zu WT-Astrozyten unten (blau) oder oben (rot) waren. g Verhältnis der „sauren“ Membranlipide Phosphatidylserin (PS) und Phosphatidylinositol (PI) in WT- und Fmr1-KO-Astrozyten. h PCA-Biplot von Phosphatidylserin (PS)- und Phosphatidylinositol (PI)-Spezies in WT- und Fmr1-KO-Astrozyten. Alle Daten wurden in der LC-MS-Lipidomics-Analyse generiert; n(WT) = 3 und n(Fmr1 KO) = 3 biologisch unabhängige Astrozytenkulturen. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Soft Independent Modeling of Class Analogies (SIMCA) bestätigte, dass die WT- und Fmr1-KO-Astrozytenproben statistisch signifikant unterschiedliche Phospholipidspezies, PC-Spezies und saure Phospholipidspezies (PS und PI) in der Zusammensetzung aufwiesen (P < 0,05).

Darüber hinaus stellten wir fest, dass die Profile der Membran-PL-Spezies in Fmr1-KO- und WT-Astrozyten unterschiedlich waren (Abb. 3c). Ein Vergleich der PL-Spezieszusammensetzung von Fmr1-KO- und WT-Astrozyten mittels Massenspektrometrie ergab, dass KO-Astrozyten erhöhte Mengen an mehrfach ungesättigten PC-, Phosphatidylethanolamin- (PE) und Phosphatidylserin- (PS) Spezies sowie einige Spezies mit den kürzesten Ketten aufwiesen und weniger PC und enthielten SM mit einer oder zwei einfach ungesättigten Acylketten (Abb. 3d – f). Das PC-Artenprofil unterschied sich auch signifikant zwischen den WT- und KO-Astrozyten (Abb. 3e). In Übereinstimmung mit den lipidomischen Befunden bei ACM zeigten die mehrfach ungesättigten Spezies höhere Konzentrationen in KO-Astrozyten, was sich wahrscheinlich auf die Vesikelbildung, die Membranflüssigkeit und die von Lipiden abgeleitete Mediatorsignalisierung auswirkt, die zusammen mit Zytokinen an einer Vielzahl biologischer Prozesse beteiligt ist. Während die Gesamtmenge an PS-Spezies in KO-Zellen erhöht war, waren die SM-Spiegel verringert (Abb. 3f). Die Phosphatidylinositol (PI)-Spiegel blieben konstant und das PS/PI-Verhältnis war in KO höher als in WT-Astrozyten (Abb. 3g, h). Unsere Ergebnisse deuten auf eine Anreicherung von Cholesterin und erhöhte mehrfach ungesättigte Membran-PLs in Fmr1-KO-Astrozyten hin.

Da die ABCA1-Aktivität an der Neuroinflammation beteiligt ist und entzündliche Faktoren an der Regulierung ihrer Expression beteiligt sind, haben wir entzündungsfördernde Mechanismen untersucht, die zu einer verringerten ABCA1-Expression und einer veränderten Cholesterinhomöostase in FXS-Astrozyten beitragen könnten. Unter Verwendung eines kommerziellen Zytokin-Antikörper-Arrays stellten wir fest, dass mehrere entzündungshemmende Zytokine in der ACM menschlicher FXS-Astrozyten reduziert waren. Interleukin-13 (IL-13) und IL-10 waren im Vergleich zu Kontrollen die am stärksten reduzierten Zytokine in FXS-Astrozyten (Abb. 4a). Da es Hinweise darauf gibt, dass IL-13 die ABCA1-Expression35 stimuliert, könnte sein niedriger Spiegel (54,3 % der Kontrolle) zur verringerten ABCA1-Expression in FXS-Astrozyten beitragen. Andererseits könnte ein verringertes IL-10 (54,3 % der Kontrolle) die Folge der niedrigen ABCA1-Expression sein36. Im Gegensatz dazu fanden wir keine ähnlich deutlichen Unterschiede bei den proinflammatorischen Zytokinen IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8 und TNF-α zwischen dem Sekretom aus Kontroll- und FXS-Astrozyten (Abb. 4a). Von den CC-Chemokinliganden im Array war die CCL1-Expression in FXS-ACM im Vergleich zu Kontrollen in wiederholten Experimenten ungewöhnlich niedrig (36,2 % der Kontrolle) (Abb. 4a). CCL1 löst die Chemotaxis von Th2 und einer Untergruppe von T-regulatorischen Zellen aus37, und seine immunmodulatorische Funktion wird nachweislich durch Statine reguliert38. RANTES (CCL5) wurde zuvor unter reduzierten Chemokinen im Plasma von FXS-Individuen identifiziert39, sein extrazellulärer Spiegel (95,4 % der Kontrolle) (Abb. 4a) oder seine zelluläre mRNA-Expression (P = 0,688) unterschieden sich jedoch nicht zwischen FXS- und Kontrollastrozyten unter Basal Bedingungen (Abb. 4b). Allerdings war die Expression von CCL5 in mit IL-1β (10 ng/ml) aktivierten FXS-Astrozyten sechsmal höher (P < 0,0001) und nach der Behandlung mit TNF-α (50 ng/ml) zweifach niedriger (P < 0,0001). ) im Vergleich zu Kontrollen (Abb. 4c), was auf Anomalien in der Reaktion auf proinflammatorische Zytokine40 in FXS-Astrozyten hinweist. Analog führte die Behandlung mit IL-1β zu einem sechsfachen Anstieg (P < 0,0001) der GFAP-Expression, wohingegen die TNF-α-Behandlung die GFAP-Expression in FXS-Astrozyten im Vergleich zu Kontrollen (zweifach) verringerte (Abb. 4d).

ein Vergleich des Zytokin- und Chemokinprofils beim Screening von menschlichen Vorderhirn-Astrozyten, die aus FXS stammen, und menschlichen Kontroll-iPSCs. Bei den Werten handelt es sich um Prozentsätze für FXS, berechnet im Vergleich zur Kontrolle in gepoolten vier Kontroll- und vier FXS-iPSC-abgeleiteten ACM. b Expression von CCL5-mRNA in Kontroll- und FXS-Astrozyten unter Verwendung der GAPDH-Expression zur Normalisierung. n(Kontrolle) = 3 und n(FXS) = 3 Zelllinien, die biologische Varianten darstellen. c CCL5- und d GFAP-mRNA-Expression in Kontroll- und FXS-Astrozyten im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen nach Behandlung mit IL-1β und TNF-α. Astrozyten wurden aus menschlichen iPSC-Kontrolllinien (HEL11.4) und FXS (HEL69.5) erzeugt und 7 Tage lang mit IL-1β (10 ng/ml) und TNF-α (50 ng/ml) behandelt. Die mRNA-Spiegel wurden mittels RT-qPCR mit drei technischen Replikaten unter Verwendung der ΔΔCt-Methode analysiert. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. ***P < 0,001 durch Zwei-Wege-ANOVA.

Das Gehirn enthält etwa 25 % des gesamten Cholesterins im Körper7. Astrozyten stellen die größte Zellpopulation dar, die an der Regulierung der Cholesterinhomöostase beteiligt ist, die für das sich entwickelnde Gehirn von entscheidender Bedeutung ist. Sowohl Astrozyten als auch Neuronen synthetisieren Cholesterin im sich entwickelnden Gehirn, aber im Gegensatz zu Neuronen akkumulieren Astrozyten normalerweise kein Cholesterin und scheiden den Großteil ihres neu synthetisierten Cholesterins aus7. Das Gleichgewicht zwischen Cholesterinsekretion und zellulärer Retention wird streng reguliert, um unerwünschte toxische Wirkungen von überschüssigem Cholesterin im extrazellulären Raum zu vermeiden41. Cholesterininduzierte Toxizität wurde als kritischer Faktor bei der Pathogenese mehrerer Krankheiten identifiziert, was zu einem Interesse am therapeutischen Einsatz von cholesterinsenkenden Medikamenten führte14,15,16,17,18,41. In der vorliegenden Studie wurden die Auswirkungen des Fehlens von FMRP auf den Cholesterinhaushalt von Astrozyten in zelltypabhängiger Weise in FXS-Astrozyten von Menschen und Mäusen untersucht. Wir haben gezeigt, dass sich eine gestörte Cholesterinhomöostase in FXS-Astrozyten in einer verringerten Expression des Cholesterintransporters ABCA1 sowohl in menschlichen als auch in Maus-Astrozyten manifestierte. In menschlichen FXS-Astrozyten war der ABCA1-Defekt mit Veränderungen in der Zytokinsekretion verbunden, während in mit Serum kultivierten Maus-Fmr1-KO-Astrozyten der ABCA1-Defekt eine Ansammlung von Cholesterin und Desmosterol verursachte, verbunden mit Veränderungen der Entzündungseigenschaften und des Lipidoms (Abb. 5).

Studien an FXS-Astrozyten des menschlichen Vorderhirns ergaben eine verringerte ABCA1- und Fettsäure (FA)-Transporter-FAT1P-Expression, die mit einem Anstieg des Cholesterin/Cholesterylester-Verhältnisses in astrozytenkonditioniertem Medium (ACM) verbunden ist. Die an der Regulierung der ABCA1-Expression beteiligten IL-13- und IL-10-Spiegel waren in der ACM menschlicher FXS-Astrozyten verringert. Reduziertes ABCA1-Protein in Fmr1-KO-Astrozyten ging mit erhöhtem Cholesterin und Desmosterol einher, während Desmosterol in Fmr1-KO-ACM erniedrigt war, was auf eine veränderte LXR/RXR-Signalübertragung hindeutet, die zum erhöhten Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFA) in FXS-Astrozyten beitrug. Veränderungen, die in menschlichen FXS- und Maus-Fmr1-KO-Astrozyten beobachtet wurden, sind in Rot bzw. Blau dargestellt.

ABCA1 ist ein Transmembranprotein, das eine entscheidende Funktion bei der Regulierung des Cholesterinhaushalts spielt, indem es den Ausfluss von intrazellulärem freiem Cholesterin und PLs durch die Plasmamembran vermittelt10. Astrozyten produzieren Cholesterin auf Nachfrage von Neuronen und ABCA1 ist der wichtigste Cholesterin-Efflux-Transporter in Astrozyten10,31. Um die Toxizität von Cholesterin zu vermeiden, muss sein Gehalt genau kontrolliert werden. Wir fanden heraus, dass der extrazelluläre Cholesteringehalt in Kulturen von FXS-Astrozyten von Mensch und Maus, die verringerte Mengen an ABCA1 exprimierten, normal aufrechterhalten wurde. Die Abnahme von ABCA1 führte zur Akkumulation von astrozytischem Cholesterin, was auf die Aktivierung eines nicht durch ABCA1 vermittelten Efflux oder eine erhöhte Diffusion schließen lässt, möglicherweise aufgrund eines größeren Cholesteringradienten zwischen mittleren Lipoproteinen und der zellulären Plasmamembran42.

Der zelluläre PC-Spiegel und die Artenzusammensetzung beeinflussen die intrazelluläre Verteilung, den Transport und die ABCA1-vermittelte Sekretion von Cholesterin28. Das PC-Speziesprofil war zwischen den Kontroll- und Fmr1-KO-Astrozyten unterschiedlich, und mehrfach ungesättigte PC-Spezies waren sowohl in Fmr1-KO-ACM als auch in Lysaten von KO-Astrozyten im Vergleich zu den Kontrollen erhöht. PC ist die am häufigsten vorkommende PL-Klasse in eukaryotischen Zellen und dient daher als Cholesterinsenke, die Zellen vor cholesterininduziertem ER-Stress schützt43. PC dient auch als Vorläufer bei der SM-Synthese, die für mit SM und Cholesterin angereicherte Membrannanodomänen erforderlich ist. In KO-Astrozyten begünstigte das Membran-PL-Profil die stark ungesättigte PC-Spezies und enthielt weniger SM, wodurch die Membran strukturell mit Cholesterin inkompatibel wurde44. Dadurch wurde die Fähigkeit der KO-Astrozytenmembranen, eine Cholesterinüberladung abzupuffern und eine Cholesterintoxizität zu verhindern, beeinträchtigt.

Der hohe Gehalt an mehrfach ungesättigten PL-Spezies in den KO-Astrozyten hatte wahrscheinlich mehrere Konsequenzen. Eine hohe PL-Unsättigung kann die physikalischen Eigenschaften der Membran verändern und die Freisetzung von CE- und TAG-haltigen Vesikeln aus ER45,46 steigern. Darüber hinaus verändert die erhöhte Verfügbarkeit des PUFA-Liganden für den Kernrezeptor LXR die LXR-vermittelte Genexpression47. Es ist bekannt, dass LXR/Retinsäure-X-Rezeptor (RXR)-Liganden die ABCA1-Expression stimulieren und eine verringerte ABCA1 in FXS-Astrozyten möglicherweise auf eine fehlerhafte LXR/RXR-Signalübertragung zurückzuführen ist, die möglicherweise durch fehlreguliertes RXRA und RXRB durch das Fehlen von FMRP48 verursacht wird. Fmr1-KO-Astrozyten zeigten außerdem einen ungewöhnlich hohen Gehalt an Desmosterol, dem zweithäufigsten Sterin im Gehirn, das an der Regulierung der synaptischen Plastizität beteiligt ist30. Es hat wichtige Signalfunktionen und hemmt als LXR-Agonist SREBP-Zielgene und programmiert den Fettsäurestoffwechsel selektiv und zelltypspezifisch um49,50. Da Desmosterol im Vergleich zu Cholesterin die Lipidpackung der Membran beeinträchtigt, könnte es zur Kontrolle der Membranflüssigkeit in Zellen mit überschüssigem Cholesterin beitragen51.

Zusätzlich zu den LXR-vermittelten Wirkungen kann Desmosterol LXR-unabhängige oxidative und entzündliche Wirkungen haben49, wohingegen PUFAs als Vorläufer verschiedener Lipidmediatoren fungieren, die zur Kontrolle von Entzündungen erforderlich sind52. Wir beobachteten, dass die sezernierten entzündungshemmenden Zytokine in menschlichem FXS-ACM niedrig waren. Insbesondere die Werte der Interleukine, die mit der Regulierung der ABCA1-Expression und der Cholesterinhomöostase verbunden sind, waren niedrig. Es ist möglich, dass niedrige IL-13-Spiegel zur verringerten ABCA1-Expression in FXS-Astrozyten beigetragen haben35. Dementsprechend könnte eine niedrige ABCA1-Expression an der Reduzierung von IL-10 in FXS ACM36 beteiligt gewesen sein. Ein Defizit an IL-10 wurde auch im Fmr1-KO-Hippocampus24 berichtet. Beeinträchtigte Immunantworten in FXS-Astrozyten stehen im Einklang mit einer zuvor festgestellten Fehlregulation mehrerer proinflammatorischer Zytokine bei Fmr1-KO-Mäusen24 und in klinischen Studien mit FXS39,53. Eine abnormale astrozytäre entzündliche IL-6-Reaktion wurde mit einer synaptischen Dysfunktion bei Fmr1-KO-Mäusen in Verbindung gebracht54.

Besonders interessant ist unser Befund, dass Fmr1-KO-Astrozyten einen hohen PS-Gehalt und geringe relative Mengen an gesättigten und einfach ungesättigten SM-Spezies aufwiesen. Serin ist der gemeinsame Vorläufer für die PS- und SM-Synthese, und daher begünstigte die Lipidsynthese in den KO-Astrozyten wahrscheinlich Wege, die PS anstelle von SM produzieren. Hohe Membran-PS aktiviert viele membrangebundene Kinasen, die als Therapieziele bei FXS55 untersucht wurden. Darüber hinaus aktiviert ein erhöhtes Verhältnis von PS zu SM, wie in den KO-Astrozyten, die Proteinkinase C durch positive Kooperativität56. Die Aktivierung der Proteinkinase C fördert die ApoA-I-induzierte Stabilisierung des ABCA1-Proteins57, das in den KO-Astrozyten herunterreguliert wird. Trotz erhöhtem PS in KO-Astrozyten blieben die PI-Werte konstant. Zahlreiche Signalfunktionen nutzen phosphorylierte PIs, die auch an der Regulierung des intrazellulären Transports von Cholesterin an Membrankontaktstellen beteiligt sind, z. B. zwischen dem ER und dem Golgi-Komplex58. Offenbar unterstützte der reichlich vorhandene PI-Vorläufer einen solchen Transport in FXS-Astrozyten.

Eine Statinbehandlung könnte die Verhaltensergebnisse bei FXS-Kindern verbessern16,17 und Lovastatin hat positive Auswirkungen auf den Phänotyp von Fmr1-KO-Mäusen14. Die Behandlung mit Lovastatin verhinderte bei diesen Mäusen die Anfälligkeit für audiogene Anfälle und eine übermäßige Proteinsynthese im Hippocampus. Die Behandlung dämpfte die neuronale Übererregbarkeit, die durch eine Überempfindlichkeit gegenüber der mGluR5-ERK1/2-Aktivierung verursacht wurde59. Da Proteinsyntheseinhibitoren diese Wirkungen jedoch nicht hervorrufen konnten und die Reaktion durch die Behandlung mit Simvastatin nicht reproduziert wurde60, blieben die Mechanismen unklar, die durch Lovastatin vermittelte positive Wirkungen auf den FXS-Phänotyp verleihen. Unsere Studie zeigte, dass eine veränderte Cholesterinhomöostase in FXS-Astrozyten mit umfassenderen Veränderungen des Lipidoms und der Entzündungsfaktoren verbunden war, die möglicherweise direkt durch Statine moduliert werden61. Die Studie legte auch nahe, dass der Anstieg der mehrfach ungesättigten Membran-PLs eine Nebenrolle bei der Beeinträchtigung des FXS-Astrozyten-Cholesterinstoffwechsels spielt. Klinische Studien haben gezeigt, dass der periphere Cholesterinspiegel bei FXS-Männern gesenkt wird, und der aktuelle Bericht von Abolghasemi et al. zeigten ein abnormales Plasmalipidprofil, einschließlich verringerter n-6-PUFAs und n-3-PUFAs in FXS21. Unter den n-3-PUFAs waren Eicosapentaensäure (EPA, 20:5n-3) und Docosahexaensäure (DHA, 22:6n-3) am stärksten reduziert. Darüber hinaus lindert die n-3-PUFA-Supplementierung von Fmr1-KO-Mäusen vom Absetzen bis zum Erwachsenenalter viele Verhaltenssymptome und neuroinflammatorische Parameter24. Mehrere klinische Studien haben positive Auswirkungen einer n-3-PUFA-Supplementierung bei ASD und ADHS gezeigt, aber nicht alle Ergebnisse sind konsistent und das Verhältnis von EPA und DHA in n-3-PUFA-Supplementen und die Gesamtnahrungsaufnahme von FAs können das klinische Ergebnis beeinflussen62, 63,64,65. Beispielsweise kann überschüssiges EPA den ABCA1-vermittelten Cholesterinausfluss funktionell hemmen66. Es gibt auch Hinweise darauf, dass EPA und DHA die Zytokinexpression unterschiedlich modulieren.67 Die Monozyten-IL-10-Expression, die in FXS-Astrozyten reduziert war, war höher, wenn die Zellen mit EPA ergänzt wurden als mit DHA. Es wurde über mögliche schädliche Auswirkungen einer Änderung des optimalen Verhältnisses von EPA zu DHA auf die kognitiven Funktionen berichtet68.

Lipide spielen eine grundlegende Rolle bei der Astrozytenfunktion, einschließlich des Energiestoffwechsels, der Aufrechterhaltung der Membran-Lipid-Protein-Wechselwirkungen und der Signalübertragung von Zelle zu Zelle. Cholesterin ist ein wichtiger Lipidbestandteil der Plasmamembran von Zellen und von entscheidender Bedeutung für die Aufrechterhaltung der Membranflüssigkeit, -dicke und -segregation der Lipiddomänen, die für mehrere Signalplattformen erforderlich sind. Cholesterin ist zusammen mit SM und PC in den Plasmamembranen und an der Oberfläche von Lipoproteinpartikeln lokalisiert. Die vorliegende Studie zeigte, dass FMRP-Mangel in Astrozyten das Gleichgewicht der Membranlipide beeinflusst, indem der Anteil der PC- und SM-Spezies mit einem geringen Grad an Ungesättigtheit, die strukturell mit Cholesterin kompatibel sind, sinkt und der Anteil der mehrfach ungesättigten PL-Spezies, die inkompatibel sind, erhöht wird mit Cholesterin, aber mit entscheidender Signalfunktion. Zusätzlich zur Hemmung der ABCA1-Funktion beim Cholesterinausfluss beeinträchtigt die veränderte Membranlipidzusammensetzung möglicherweise direkt oder durch Veränderung der Doppelschichtsteifigkeit und hydrophoben Fehlpaarung zwischen Transmembrandomänen und der Lipiddoppelschicht die Funktionen mehrerer Kanäle auf der Membran69. Unsere Ergebnisse unterstreichen zunächst die Rolle von ABCA1 bei der Regulierung des Cholesterins in FXS-Astrozyten und ermutigen zu weiteren Studien zur Erforschung von ABCA1, dessen gezielte Behandlung möglicherweise positive Auswirkungen auf FXS hat. Zweitens deuten die beobachteten Anstiege mehrfach ungesättigter PLs in den Fmr1-KO-Astrozyten darauf hin, dass weitere Studien zur Regulierung des Membran-PL-Profils erforderlich sind, um neuartige Behandlungen unter Verwendung des von menschlichen iPSC abgeleiteten Astrozytenmodells zu entwickeln.

Menschliche Vorderhirnastrozyten wurden wie zuvor beschrieben70 aus männlichen FXS (HEL69.6, HEL70.3, HEL70.6 und HEL100.2) und Kontrolle (HEL23.3, HEL24.3, HEL46.11, PO2/UEF-3A) erzeugt. und PO4/UEF-3B) iPSC-Linien71,72,73,74,75. Darüber hinaus wurden Astrozyten von der männlichen FMR1-KO-hESC-Linie, die eine FXS-verursachende Mutation trägt, und von ihren isogenen Kontroll-hESCs (H1) unterschieden76. Von allen Spendern der für die Neuprogrammierung verwendeten Zellen wurde eine Einverständniserklärung eingeholt. Die Forschung mit menschlichen Zellen wurde von der Ethikkommission des Krankenhausbezirks Helsinki und Uusimaa, Finnland, genehmigt.

Kurz gesagt, menschliche pluripotente Stammzellen (hPSCs) wurden auf Matrigel-beschichteten Platten in Essential 8-Medium (E8; Thermo Fisher Scientific Ltd., Vantaa, Finnland) gehalten. Zur Differenzierung wurden 80 % konfluente hPSCs mit 0,5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) dissoziiert und auf einer Low-Attachment-Platte mit sechs Vertiefungen in E8 mit 20 ng/ml menschlichem basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF2) ausplattiert ; Peprotech, Somerset County, NJ, USA) und 20 µM Rho-Kinase-Inhibitor (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Am folgenden Tag wurde das Medium durch neuronales Induktionsmedium ersetzt [Advanced Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)/F12, 1× N2, 2 mM L-Glutamin, 1× nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA) und 1 × Penicillin-Streptomycin (PS) (alle von Thermo Fisher Scientific)] ergänzt mit 0,1 µM LDN-193189 (Stemgent), 1 µM Cyclopamin (Sigma-Aldrich), 10 µM SB-431542 (Sigma-Aldrich) und 0,5 µg/ ml DKK1 (Dickkopf-verwandtes Protein 1; Peprotech). Advanced DMEM/F12 ermöglicht eine Serumreduktion aufgrund der Zugabe von Ethanolamin, Glutathion, Ascorbinsäure, Insulin, Transferrin, AlbuMAX™ II lipidreichem Rinderserumalbumin (BSA) für die Zellkultur und den Spurenelementen Natriumselenit, Ammoniummetavanadat und Kupfersulfat und Manganchlorid. Nach 12 Tagen in vitro (DIV) wurde das Medium durch neuronales Induktionsmedium, ergänzt mit 20 ng/ml neurotrophem Faktor aus dem Gehirn (BDNF; Peprotech), und nach 30 Tagen durch Neurosphärenmedium (Advanced DMEM/F12, 1× B27) ersetzt -RA, 1× L-Glutamat, 1× NEAA, 1× Penicillin-Streptomycin (PS) [alle von Thermo Fisher Scientific]), ergänzt mit 20 ng/ml bFGF2 und 20 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor (Peprotech). Wachstumsfaktoren wurden dreimal pro Woche hinzugefügt und die Kugeln wurden etwa einmal pro Woche manuell dissoziiert. Bei 60 DIV wurden die Kugeln dissoziiert und die Vorläufer auf Polyornithin/Laminin-beschichteten (Sigma-Aldrich) Kulturplatten in Neurosphärenmedium, ergänzt mit 20 ng/ml ziliarem neurotrophen Faktor (CNTF; Peprotech), ausplattiert. Die Zellen wurden etwa einmal pro Woche mit Trypsin-EDTA (0,05 %) (Thermo Fisher Scientific) passagiert und mit 20.000 Zellen/cm2 ausgesät. Nach 75 DIV hatten die Zellen die Morphologie von Astrozyten angenommen und wurden auf Matrigel-beschichteten Kulturplatten gehalten. Das Fehlen von FMRP in von FXS iPSC abgeleiteten Astrozyten wurde in unseren früheren Studien bestätigt. Alle Zellkulturen wurden regelmäßig mit einem Mycoplasma-Nachweiskit (MycoAlert, Lonza Group Ltd.) auf Mykoplasmenkontamination getestet.

Zur Immunfärbung menschlicher Astrozyten wurden 30.000 Zellen/Well auf mit Laminin/Poly-L-Ornithin (Sigma-Aldrich) beschichteten Deckgläsern in 24-Well-Platten ausplattiert, 15 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und gewaschen viermal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Auf die Permeabilisierung der Zellen mit 2 % BSA, 5 % Saccharose, 5 % Magermilch und 0,1 % Triton in PBS, ergänzt mit 2 % BSA, 5 % Saccharose und 0,05 % Triton X-100. Primärantikörper waren Hühner-Anti-GFAP (Abcam, Ab#4674, 1:500) und Maus-Anti-ABCA1 (Abcam, Ab#18180, 1:500). Sekundärantikörper waren Anti-Hühner-Alexa-Fluor 488 und Anti-Maus-Alexa-Fluor 647 (beide von Invitrogen, 1:1000). Die Kerne wurden mit 4'6-Diamino-2-phenylindol (DAPI; Sigma, D9542, 1:10000) gefärbt und mit Shandon Immuno-Mount (Thermo Scientific) montiert.

Die gefärbten Zellen wurden mit dem Pannoramic 250 (Flash III)-Scanner (3D Histech, Budapest, Ungarn) mit 20X-Objektiv (NA 0,8) und sMOS PCO.edge 5,5 2MP-Kamera gescannt. Die Bilder wurden mit ImageJ analysiert. Der Intensitätsschwellenwert wurde auf 10/255 eingestellt, um Zellen vom Hintergrund zu unterscheiden. Zur Berechnung der Fläche und der mittleren Intensität in jeder abgebildeten Zelle wurde ein automatisiertes Partikelanalysetool verwendet. Der Bereichsschwellenwert wurde auf mehr als 500 Pixel festgelegt. Die mittlere intrazelluläre Intensität wurde bestimmt und durch Subtrahieren der Hintergrundintensität korrigiert.

Männliche Fmr1-KO- und Wildtyp-Mäuse auf einem kongenen C57BL/6-Hintergrund (The Jackson Laboratory) wurden am ersten postnatalen Tag (P1) verwendet. Alle Studien wurden gemäß den Richtlinien des National Institutes of Health und des Institutional Animal Care and Use Committee der University of California Riverside durchgeführt. Die Mäuse wurden in einer von der American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) akkreditierten Einrichtung unter einem standardmäßigen 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus gehalten und erhielten nach Belieben Zugang zu Futter und Wasser.

Primärkulturen kortikaler Astrozyten wurden wie zuvor beschrieben aus den Neokortizes von P1 Fmr1 KO und Wildtyp-Mäusen hergestellt77. Die Mäuse wurden durch Kühlen auf Eis kurz anästhesiert und mit Ethanol gereinigt. Die Gehirne wurden präpariert und in eiskaltes PBS, ergänzt mit 25 mM Glucose und 0,1 % Rinderserumalbumin (PGB), gelegt. Kortizes wurden präpariert und Hirnhäute entfernt. Hirngewebe wurde in Papain (0,5 mg/ml)-DNAse (10 μl/ml) PGB bei 37 °C 20 Minuten lang inkubiert. Gewebestücke wurden durch 5-minütige Zentrifugation bei 300 × g gesammelt und vorsichtig verrieben. Die Zellen wurden in T25-Gewebekulturflaschen ausplattiert, die durch 1–2-stündiges Beschichten bei 37 °C mit 50 μg/ml Poly-d-Lysin in einer Konzentration von ~0,5 × 106 Zellen/ml in DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, hergestellt wurden ( FBS) und 1× PS (alle von Thermo Fisher Scientific). Astrozyten wurden in einem befeuchteten 10 % CO2-Inkubator eine Woche lang bis zur Konfluenz gezüchtet und anhaftende Mikroglia wurden durch 2-stündiges Schütteln bei 180 U/min und 30-minütiges Schütteln bei 240 U/min entfernt, gefolgt von einem Medienwechsel. Die Zellen wurden mit Trypsin-EDTA (0,05 %) (Thermo Fisher Scientific) abgelöst und in der Dichte von 1 × 106 Zellen auf beschichtete T25-Kolben ausplattiert. Das Astrozytenkulturmedium bestand aus DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 1 × PS (alle von Thermo Fisher Scientific), und das Medium wurde alle 2–3 Tage gewechselt. Maus-Astrozyten wurden für Lipidomic-Experimente mit Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MC) bei 24 DIV verwendet.

Zur Immunfärbung wurden Maus-Astrozyten auf Poly-D-Lysin-beschichteten Glasdeckgläsern mit einer Dichte von 5 × 104 Zellen in 24-Well-Platten ausplattiert. Nach zwei Tagen bei 25 Tagen in vitro (DIV) wurden Astrozyten 30 Minuten lang bei RT mit 2 % Paraformaldehyd fixiert und dreimal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit 0,1 % Triton X-100 in PBS 30 Minuten lang permeabilisiert und mit 1 % normalem Eselserum 1 Stunde lang bei RT blockiert. Die Zellen wurden mit primärem Antikörper in PBS, ergänzt mit 2 % BSA und 0,05 % Triton X-100 (PBST), über Nacht bei 4 °C inkubiert, viermal mit PBST gewaschen und dann 2 Stunden lang mit sekundärem Antikörper bei RT inkubiert. Glasdeckgläser wurden mit Vectashield-Eindeckmedium montiert. Primärantikörper waren Maus-Anti-ABCA1-Antikörper (1:500, Abcam, ab18180) und Kaninchen-Anti-GFAP (1:500, Cell Signaling Technology, 12389 T). Sekundärantikörper waren FITC-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG (1:500, Invitrogen, 31569) und AlexaFluor-594-konjugiertes Esel-Anti-Kaninchen-IgG (1:500, Invitrogen, AB150076).

Konfokale Bilder von kultivierten Mausastrozyten wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop SP5 (Leica Microsystems) aufgenommen. Hochauflösende optische Schnitte (Format 1024 × 1024 Pixel) wurden mit einem 20-fachen Zoom in Schrittintervallen von 0,5 μm aufgenommen. Für die ABCA1-Analyse wurden mindestens 10 Bilder pro Kultur (100–200 Astrozyten) mit 4–5 Kulturen pro Gruppe aufgenommen. In Bild J wurde jeder Z-Stapel durch Projektion zu einem einzigen Bild zusammengefasst und nach Farbe aufgeteilt. GFAP-exprimierende Zellen wurden skizziert und im ROI-Manager gespeichert und zur Messung der Fläche und der mittleren Intensität der ABCA1-Immunreaktivität in GFAP-exprimierenden Zellen verwendet und durch Subtraktion der Hintergrundintensität korrigiert. Für jedes Bild (10–20 Zellen) wurde die durchschnittliche Intensität der ABCA1-Immunreaktivität berechnet.

Für die Sammlung wurden humane ACM-Zellen auf Matrigel-beschichteten T25-Kolben mit einer Dichte von 20.000 Zellen/cm2 ausplattiert und 7 Tage lang gezüchtet. Am Tag vor der Probenentnahme wurde das Medium durch 5 ml frisches Neurosphärenmedium ersetzt. Wie angegeben wurden die Zellen 24 Stunden lang mit all-trans-Retinsäure (ATRA) behandelt. Das gesammelte Medium wurde durch einen 0,22-µm-Filter filtriert und bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert. Maus-ACM wurde einen Tag nach dem Wechsel des Mediums zu frischem DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 1 × PS, gesammelt. Die Proben wurden bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert.

Die Cholesterinkonzentration wurde in ACM von menschlichem FXS und Kontrollastrozyten unter Verwendung des Cholesterin-Quantifizierungskits (Sigma-Aldrich) und fluorometrischer Detektion gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Alle Proben und Standards wurden im Duplikat getestet.

Das Zytokinprofil in ACM wurde unter Verwendung eines Human Cytokine Antibody Array (Abcam, Cambridge, UK, Ab133998) analysiert. ACM wurde durch Ausplattieren der Zellen auf Matrigel-beschichteten T25-Kolben mit einer Dichte von 20.000 Zellen pro cm2 hergestellt und 7 Tage lang gezüchtet. Das Medium wurde einen Tag vor der Probenentnahme durch 5 ml frisches NS ersetzt, die durch einen 0,22-µm-Filter filtriert und bei –80 °C gelagert wurden. Für die Analyse wurden Medien von vier iPSC-abgeleiteten Astrozytenlinien gepoolt und ein Array mit unverdünntem Medium gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Der Chemilumineszenznachweis wurde mit einem ChemiDoc-Bildgebungssystem (Bio-Rad Finnland, Helsinki, Finnland) durchgeführt und densitometrische Daten wurden mit der ImageJ-Software erhalten. Zur Hintergrundkorrektur bzw. Normalisierung wurden mittlere Intensitäten negativer und positiver Kontrollpunkte verwendet.

Die Lipidomics-Analyse mittels Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) wurde wie zuvor beschrieben an der UC Riverside Metabolomics Core Facility durchgeführt78. Kurz gesagt, die Analyse wurde mit einem Waters G2-XS Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometer durchgeführt, das an ein UPLC-System der Waters Acquity I-Klasse gekoppelt war. Die Trennungen wurden auf einer Waters CSH C18-Säule (2,1 × 100 mm, 1,7 µM) durchgeführt. Die mobilen Phasen waren (A) 60:40 Acetonitril: Wasser mit 10 mM Ammoniumformiat und 0,1 % Ameisensäure und (B) 90:10 Isopropanol: Acetonitril mit 10 mM Ammoniumformiat und 0,1 % Ameisensäure. Die Flussrate betrug 400 µl/min und die Säule wurde auf 65 °C gehalten. Das Injektionsvolumen betrug 2 µl. Der Gradient war wie folgt: 0 min, 10 % B; 1 Minute, 10 % B; 3 Min., 20 % B; 5 Min., 40 % B; 16 Min., 80 % B; 18 Min., 99 % B; 20 Min. 99 % B; 20,5 Min., 10 % B. Der MS-Scanbereich betrug (50–1600 m/z) mit einer Scanzeit von 100 ms. MS/MS wurde datenabhängig erfasst. Die Quellen- und Desolvatisierungstemperaturen betrugen 150 °C bzw. 600 °C. Desolvatisierungsgas wurde auf 1100 l/h und Kegelgas auf 150 l/h eingestellt. Alle Gase waren Stickstoff, mit Ausnahme des Kollisionsgases, bei dem es sich um Argon handelte. Die Kapillarspannung betrug 1 kV im positiven Ionenmodus und 2 kV im negativen Modus. Eine Qualitätskontrollprobe, die durch Zusammenführen gleicher Aliquots jeder Probe erzeugt wurde, wurde regelmäßig analysiert, um die Systemstabilität und -leistung zu überwachen. Für die Datenerfassung wurden 6 μl Injektionsvolumen verwendet. Die Proben wurden in zufälliger Reihenfolge analysiert. Leucin-Enkephalin wurde infundiert und zur Massenkorrektur verwendet.

Die ungezielte Datenverarbeitung (Peakpicking, Ausrichtung, Entfaltung, Integration, Normalisierung und Spektralanpassung) wurde in der Progenesis Qi-Software (Nonlinear Dynamics) durchgeführt. Die Daten wurden auf die Gesamtionenhäufigkeit der Probe, die gesamte PL-Häufigkeit oder die Gesamthäufigkeit einer bestimmten Lipidklasse normalisiert. Merkmale mit einem CV > 30 % über alle QC-Injektionen hinweg wurden entfernt79,80. Um die Identifizierung von Merkmalen zu erleichtern, die zum selben Metaboliten gehören, wurde den Merkmalen mithilfe von RAMClust79,81 eine Cluster-ID zugewiesen. Eine Erweiterung der Richtlinien der Metabolomics-Standardinitiative wurde verwendet, um die Annotationsebenenkonfidenz zuzuweisen82,83. Lipide wurden anhand der Übereinstimmung von Retentionszeit, genauen MS-m/z-Werten und MS/MS-Spektren im Vergleich zu einer internen Datenbank identifiziert, die mit authentischen Standards erstellt wurde (z. B. für Desmosterol), der Lipidblast-in-silico-Datenbank84 (z. B. für verschiedene PL-Spezies) oder durch Verwendung externer Datenbanken, einschließlich mehrerer massenspektroskopischer Metabolitenbibliotheken in der Mass Bank of North America, Metlin85 (z. B. für Cholesterin und CE-Spezies, die separat erfasst und identifiziert und zur CE-Gesamtsumme zusammengefasst werden).

Die gesamte zelluläre RNA wurde mit dem NucleoSpin RNA-Kit (QIAGEN) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert und mit dem iScriptTM-cDNA-Synthese-Kit (Bio-Rad, Nr. 170-8891) in komplementäre cDNA revers transkribiert. Unter Verwendung von cDNA als Vorlage wurde RT-qPCR mit HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Mix Plus (Solis BioDyne) und LightCycler® 480 (Roche) für 45 Zyklen bei 95 °C für 15 s, 62 °C für 20 s und 72 s durchgeführt °C für 20 s. Die Genexpression wurde mit der ΔΔCt-Methode unter Verwendung der GAPDH-Expression zur Normalisierung analysiert. Experimente wurden mit drei technischen Replikaten durchgeführt. Astrozyten wurden wie angegeben 7 Tage lang mit IL-1β (10 ng/ml) und TNF-α (50 ng/ml) behandelt. Die Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt.

RNA-Sequenzierungsdaten (RNA-seq) wurden unter Verwendung dreifacher Proben isogener hPSC-Zellen (H1-Kontroll- und FMR1-KO-Zelllinien) auf 95 DIV und der NextSeq500-Plattform generiert. Die Sequenzierungsablesungen wurden nach Qualität und Länge gefiltert, und nach dem Entfernen des Adapters wurden die Reads mit Star Aligner (Version 2.5.0b) auf das menschliche Genom ausgerichtet und mit Hochdurchsatzsequenzierung gezählt. Die Analyse der differentiellen Expression wurde mit dem R-Paket DESeq2 durchgeführt. Ein Vergleich der drei D95-FXS-Proben mit den beiden isogenen Kontrollproben wurde durchgeführt, um Gene zu erkennen, deren Expression sich signifikant unterschied.

Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Der Student-t-Test wurde verwendet, um Unterschiede zwischen Kontroll- und FXS/Fmr1-KO-Astrozyten zu bestimmen, mit Ausnahme der Expression von CCL5 und GFAP als Reaktion auf Zytokine, wo ANOVA unter Verwendung von SPSS Statistics 25 (IBM, Armonk, NY, USA) durchgeführt wurde. Lipidvariablen in den Versuchsgruppen wurden durch Wärmekarten (unter Verwendung euklidischer Abstände und Darstellung von maximal 50 am signifikantesten abweichenden Variablen durch t-Test), Vulkandiagramme (unter Verwendung eines Fold-Change-Schwellenwerts von 1,3, eines P-Wert-Schwellenwerts von 0,05 und einer Korrektur der Falscherkennungsrate) nachgewiesen. und Hauptkomponentenanalyse 2D-Ergebnisdiagramm mit 95 %-Konfidenzbereichen oder Biplots (Ergebnisse und Belastungen). Die Analysen wurden mit MetaboAnalyst 5.0 (Freeware von Xia Lab @ McGill) durchgeführt. Die weiche unabhängige Modellierung von Klassenanalogien (SIMCA, ein quantitativer Test unter Verwendung von PCA-basierten Gruppenmodellen)86 wurde verwendet, um zu testen, ob die Unterschiede zwischen den Phospholipidspezieszusammensetzungen der WT- und Fmr1-KO-Probengruppen statistisch signifikant unterschiedlich waren. SIMCA wurde mit der Software Sirius V8.5 (Pattern Recognition Systems PRS, Bergen, Norwegen) durchgeführt. Ein P-Wert von <0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Die Experimente mit menschlichen Astrozyten wurden mit Zellen durchgeführt, die aus mindestens drei verschiedenen menschlichen FXS-iPSC-Linien stammten, die biologische, patientenspezifische Replikate und Kontrollen darstellten, mit Ausnahme von Studien zu Zytokinreaktionen, bei denen es sich um drei separate Kulturen sowohl der HEL11.4-Kontroll- als auch der HEL69.5-Zelllinien handelte gebraucht. Das Chemokin- und Zytokinprofil von FXS und Kontrollastrozyten wurde in gepoolten Proben gezeigt. Wir verwendeten Kulturen von drei Fmr1-KO- und WT-Mäusen in der LC-MS-Analyse und 4–5 Kulturen beider genetischer Gruppen für ABCA1-Expressionsstudien.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Die RNA-seq-Daten sind in der Gene Expression Omnibus-Datenbank unter der Zugangsnummer GSE228378 verfügbar. Quelldaten für Grafiken und Diagramme finden Sie in den Ergänzenden Daten.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Jari Koistinaho für die humanen Kontroll-iPSC-Linien P02 und P04 und Mahmoud Pouladi für die isogenen FMR1-KO- und Kontroll-H1-hESC-Linien. Wir danken auch Ulla-Kaisa Peteri für ihren anfänglichen Beitrag zum Forschungsprojekt und die Dienstleistungen der Biomedicum Imaging Unit und des FIMM Digital Microscopy, DNA Sequencing and Genomics Laboratory am Institut für Biotechnologie sowie der Molecular Pathology Unit, die von der Universität Helsinki und dem Biocenter unterstützt werden Finnland und Metabolomics Core unterstützt von UCR. Die Arbeit wurde durch Zuschüsse der FRAXA Research Foundation (an MLC und IME), der Academy of Finland, der Arvo and Lea Ylppö Foundation und der Finnish Foundation for Pediatric Research unterstützt. VAW wird durch ein TRANSCEND-Stipendium des California Institute of Regenerative Medicine (Auszeichnung Nr. EDUC4-12752) unterstützt. Open Access finanziert von der Universitätsbibliothek Helsinki.

Abteilung für Physiologie, Medizinische Fakultät, Universität Helsinki, Helsinki, Finnland

Karo Talvio, Rimante Minkeviciene und Maija L. Castrén

Abteilung für biomedizinische Wissenschaften und Graduiertenprogramm für Neurowissenschaften, School of Medicine, University of California Riverside, Riverside, CA, USA

Victoria A. Wagner, Anna O. Kulinich und Iryna M. Ethell

Metabolomics Core Facility, Institut für Integrative Genombiologie, University of California Riverside, Riverside, CA, USA

Jay S. Kirkwood, Anil Bhatia und Manhoi Hur

Gen- und Zelltechnologie, AIVirtanen-Institut, Universität Ostfinnland, Kuopio, Finnland

Juzoh Umemori

Lipidomics Unit der Universität Helsinki, HiLIPID, Helsinki Institute of Life Science, HiLIFE, Biocenter Finland (Metabolomics) und Forschungsprogramm für molekulare und integrative Biowissenschaften, Fakultät für Bio- und Umweltwissenschaften, Universität Helsinki, Helsinki, Finnland

Reijo Käkelä

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MLC und IME haben das Projekt konzipiert. RK lieferte zusätzliche Eingaben und analysierte Lipiddaten. VAW, AOK, RM, JU, IME und MLC führten Experimente durch und analysierten Daten. JSK, AB und MH führten massenspektrometrische Analysen durch. KT analysierte die Daten und trug zur Illustration und Fertigstellung des Manuskripts bei. MLC und RK haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse und trugen zum Manuskript bei.

Korrespondenz mit Maija L. Castren.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Eliana Scemes und Joao Valente. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Talvio, K., Wagner, VA, Minkeviciene, R. et al. Ein iPSC-abgeleitetes Astrozytenmodell des fragilen X-Syndroms weist eine gestörte Cholesterinhomöostase auf. Commun Biol 6, 789 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05147-9

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Eingegangen: 29. September 2022

Angenommen: 14. Juli 2023

Veröffentlicht: 29. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05147-9

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